韓 琴，朱繼峰，呂年銀，佟書娟，張偉偉

(1. 南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與生命科學學院病原與免疫學教研室，江蘇 南京 210023；2. 南京醫(yī)科大學江蘇省現代病原生物學重點實驗室，江蘇 南京 211166)

血吸蟲病是在全球廣泛流行，且嚴重危害人類健康和生活的感染性寄生蟲疾病之一。已經明確血吸蟲感染可以導致蟲卵沉積肝臟，形成蟲卵肉芽腫，并繼發(fā)纖維化，是其最嚴重的病理變化[1]。迄今的研究已經公認，CD4+T應答介導了血吸蟲肝臟病理的形成發(fā)展，其中，有關Th1/Th2應答介導血吸蟲肝臟病理的研究是最明確和最多的[2-3]。近年來，研究報道Th17和Treg應答也參與調控血吸蟲病肝臟肉芽腫的發(fā)生發(fā)展[4-5]。血吸蟲可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen, SEA)可以引起機體的Th17應答，其產生的IL-17A能募集中性粒細胞到蟲卵周圍，促進肉芽腫的形成發(fā)展，而Treg細胞也在肉芽腫的形成發(fā)展中發(fā)揮負向調控作用，但目前具體機制不清楚。研究發(fā)現，Th17/Treg平衡在肝損傷病程發(fā)展中發(fā)揮重要調節(jié)作用。因此，從調控Th17/Treg應答平衡入手，尋找有效的治療藥物，可以成為防治血吸蟲肝臟肉芽腫的合理切入點。

白藜蘆醇是一種存在于虎杖、花生等多種植物中，具有多樣生物學效應的天然活性成分[6-7]，其具有的免疫調節(jié)功能，已經被證明可治療或改善多種免疫性疾病。本課題組前期研究發(fā)現，白藜蘆醇可以調控Th1/Th2應答，抑制血吸蟲病的肝臟纖維化，但是白藜蘆醇是否也可以通過調控Th17/Treg應答，影響血吸蟲病肝臟肉芽腫，目前還未有研究[8]。文獻報道，白藜蘆醇可以上調Treg應答治療潰瘍性腸炎，同時，其還可以通過抑制中性粒細胞趨化，發(fā)揮抗炎效應[9-10]。這些都提示白藜蘆醇可能通過調控Th17/Treg應答，抑制血吸蟲病肝臟肉芽腫。本研究擬采用白藜蘆醇灌胃日本血吸蟲感染小鼠，探討白藜蘆醇對Th17/Treg平衡及相應肝臟肉芽腫的影響，為白藜蘆醇治療血吸蟲病提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物與陽性釘螺清潔級6～9周齡♀C57BL/6小鼠60只, 購自南京大學模式動物研究所[SCXK(蘇)2015-0001]。日本血吸蟲感染性釘螺，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2試劑白藜蘆醇(純度為98%以上，批號：KA080CA14)，購自上海源葉生物技術有限公司；吡喹酮，購自南京制藥廠有限公司(批號：20091202)；流式抗體倉鼠抗小鼠CD3e-APC、大鼠抗小鼠IL-17-PE、大鼠抗小鼠CD4-FITC、Treg檢測試劑盒，均購自eBioscience公司；破膜固定劑試劑盒(Fix/Perm Cell Permeabilization Kit)購自BD公司；小鼠Foxp3、IL-17A、CXCL1、CXCL2的引物，購自上海英駿生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒，購自Fermantas公司；SYBR Green PCR Master Mix，購自Roche公司。

1.3儀器FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；7 500型實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；低溫離心機(德國Eppendorf 公司)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)；倒置顯微鏡與照像系統(日本Nikon公司)。

1.4感染模型的建立與分組C57BL/6小鼠45只，每只小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(12±2)條。自感染3周后，血吸蟲感染小鼠隨機分為3組：感染組、白藜蘆醇組(從感染第6周連續(xù)3周灌胃給予白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1)、吡喹酮組(從感染后第3、6周，分別灌胃給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1×3 d)，每組15只。另取正常健康小鼠15只作為對照組，白藜蘆醇和吡喹酮的劑量參照已發(fā)表文獻[8]。

1.5病理學檢查在血吸蟲感染第9周，摘取各組小鼠的肝臟左葉，多聚甲醛固定，進行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，于低倍鏡(×200)下選取單個蟲卵肉芽腫,采用Axiovision software計算肉芽腫面積，每只小鼠取50～100個單個蟲卵肉芽腫面積的均值為有效值。根據HE染色下的中性粒細胞特征，計數單個蟲卵肉芽腫中的中性粒細胞數目，每只小鼠取50個單個蟲卵肉芽腫進行中性粒細胞計數。

1.6小鼠成蟲及肝臟蟲卵計數在感染第9周處死各組小鼠，采用生理鹽水心臟灌注法結合玻片擠壓法，從門靜脈收集蟲體，計算成蟲數目。取一小塊肝臟，稱取重量(M)后，放入5% KOH中，37 ℃孵育過夜。待肝臟全部消化后，用5 mL PBS重懸，1 500 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄上清。再用1 mL PBS緩沖液重懸蟲卵，取10 μL蟲卵懸液放到載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下計數，每只小鼠計數至少4次，取多次計數的平均值(N)。采用公式計算得出每克肝臟蟲卵數：每克肝臟蟲卵數=N×200/M。

1.7體外SEA刺激和分組取6～9周齡♀C57BL/6小鼠的脾臟，研磨制備成單細胞懸液，用完全RPMI 1640培養(yǎng)基，將細胞濃度調至2×109·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板，分為4組：PBS處理組(只加入PBS)、SEA處理組(加入終濃度為20 mg·L-1的SEA)、白藜蘆醇處理組(終濃度為20 mg·L-1SEA+終濃度20 mg·L-1白藜蘆醇)、吡喹酮處理組(終濃度為20 mg·L-1SEA+終濃度100 mg·L-1吡喹酮)，共培養(yǎng)72 h后收集細胞。

1.8流式細胞術檢測脾淋巴組織中Th17和Treg細胞比例在感染第9周,制取小鼠脾臟單細胞懸液，濃度調至1×109·L-1。取1 mL細胞懸液，加入濃度為1 mg·L-1佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)、50 mg·L-1離子霉素及0.7 mL·L-1莫能菌素(Golgistop)，培養(yǎng)6 h。重懸細胞于100 μL PBS。加入CD3e-APC(0.2 g·L-1)和CD4-FITC(0.5 g·L-1)抗體， 4 ℃避光孵育20 min。PBS清洗1遍，加入Fixation/ Permeabilization Solution 1 mL，4 ℃避光孵育40 min。離心去上清，加入100 μL Perm/Wash buffer重懸細胞，加入抗體IL-17-PE(0.2 g·L-1)，4 ℃避光孵育30 min。洗2遍，加入質量濃度為10 g·L-1的多聚甲醛500 μL，用流式細胞儀檢測。對Treg細胞，加入0.6 μL CD4-FITC(0.5 g·L-1)和0.6 μL CD25-APC(0.2 g·L-1)抗體，4 ℃避光孵育30 min。重懸細胞于100 μL Flow cytometry staining buffer中，加入Fixation/Permeabilization工作液1 mL，于4 ℃避光孵育2 h。洗2遍，重懸細胞于100 μL Permeabilization buffer中，加2μL Fc受體阻斷劑， 4 ℃避光孵育15 min。加入2.5 μL Foxp3-PE，4 ℃避光孵育30 min后，洗2遍, 加入質量濃度為10 g·L-1的多聚甲醛500 μL，流式細胞儀檢測。

1.9實時定量RT-PCR檢測肝組織中IL-17A、Foxp3、CXCL1、CXCL2的mRNA水平摘取感染9周的每組小鼠肝組織50 mg，TRIzol提取總RNA，按M-MLV轉錄cDNA。IL-17A、Foxp3、CXCL1、CXCL2的反應體系都為SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，反轉錄cDNA 5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 3 μL，總體積20 μL。實時熒光定量PCR的反應條件為：95 ℃ 10 min，40個循環(huán)：60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，熔解曲線60～90 ℃保證擴增為單一產物。以Ct值進行結果分析，采用相對量法與內參β-actin進行比較。2-ΔCT法計算,ΔCt=Ctgene-Ctcontrol。

1.10統計學分析數據結果用SPSS 15.0軟件進行統計分析，并用GraphPad Prism 7.0軟件制作統計圖。多組間差異比較采用F檢驗。

2 結果

2.1不同治療組小鼠的肝臟肉芽腫病理日本血吸蟲感染后第9周，光鏡下可見健康對照組小鼠的肝臟正常，未見任何病理變化；感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠肝臟中均可見明顯的蟲卵肉芽腫。計算單個蟲卵肉芽腫面積發(fā)現，白藜蘆醇和吡喹酮治療組單個蟲卵肉芽腫面積明顯小于感染組(P<0.01)，且白藜蘆醇治療組單個蟲卵肉芽腫面積小于吡喹酮治療組(P<0.05)(Fig 1A、1B)。統計比較組成單個蟲卵肉芽腫的各類細胞發(fā)現，白藜蘆醇治療組肉芽腫中的中性粒細胞數量明顯少于感染組和吡喹酮治療組(P<0.01，Fig 1C)。提示白藜蘆醇能明顯抑制血吸蟲肝臟肉芽腫反應。

2.2不同治療組小鼠的成蟲荷與卵荷為了明確白藜蘆醇是否通過影響成蟲發(fā)育或者產卵情況，從而抑制肝臟肉芽腫反應，本研究檢測血吸蟲感染9周后，不同治療組的成蟲荷和卵荷。如Fig 2所示，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組均見由尾蚴發(fā)育而來的成蟲，且感染組、白藜蘆醇治療組的成蟲荷均明顯多于吡喹酮治療組(P<0.05)。在感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠肝臟中，均見蟲卵沉積。比較肝臟中的蟲卵發(fā)現，感染組、白藜蘆醇治療組的卵荷明顯多于吡喹酮治療組(P<0.01)。不論是成蟲荷還是卵荷，感染組和白藜蘆醇治療組之間差異均無顯著性(P>0.05)。

2.3不同治療組小鼠的Th17與Treg應答如Fig 3所示，血吸蟲感染9周后，與對照組相比，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠脾臟淋巴細胞中Th17細胞(CD3+CD4+IL-17+)占總T細胞(CD3+)的比例都明顯增高(P<0.05)，Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)占CD4+細胞的比例也明顯增高(P<0.05)。但是白藜蘆醇和吡喹酮治療組的Th17細胞比例明顯低于感染組(P<0.05)，而白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組之間Th17細胞比例差異無顯著性(P>0.05)。同時，白藜蘆醇治療組的Treg細胞比例明顯高于感染組和吡喹酮治療組(P<0.05)，而感染組與吡喹酮治療組相比沒有統計學差異(P>0.05)。

Fig 1 The hepatic granuloma in different

1：infected;2:resveratrol;3:praziquantel;4:control. A: Single granuloma in liver; B: Areas of single granuloma; C: Number of neutrophils in single granuloma.##P<0.01vsinfected group;△P<0.05,△△P<0.01vspraziquantel group.

2.4不同治療組小鼠肝臟中IL-17A、Foxp3、CXCL1、CXCL2的mRNA水平如Tab 1所示，血吸蟲感染9周后，與健康對照組比較，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠的肝臟中IL-17A、Foxp3、CXCL1、CXCL2 mRNA表達均明顯增高(P<0.01)，且感染組和吡喹酮治療組小鼠肝臟IL-17A、CXCL1、CXCL2的mRNA表達水平均明顯高于白藜蘆醇治療組(P<0.05),而白藜蘆醇治療組Foxp3 mRNA水平明顯高于感染組和吡喹酮治療組(P<0.01)。感染組和吡喹酮治療組IL-17A、Foxp3、CXCL1、CXCL2的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

Fig 2 Number of adult worms and eggs in different n=15)

1：infected;2:resveratrol;3:praziquantel;4:control. A: Number of adult worms; B: Number of eggs per gram in liver.△P<0.05,△△P<0.01vspraziquantel group.

Fig 3 Proportions of Th17, Treg cells in different groups n=15)

1：infected;2:resveratrol;3:praziquantel;4:PBS. A: Flow cytometry of Th17 cells; B: Percentage of Th17 cells; C: Flow cytometry of Treg cells; D: Percentage of Treg cells.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsinfected group;△P<0.05vspraziquantel group.

Tab 1 The mRNA levels of IL-17A, CXCL1, CXCL2, Foxp3 in liver from different groups

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsinfected group;△P<0.05,△△P<0.01vspraziquantel group

Fig 4 Proportions of Th17, Treg cells in different treated groups in

1：infected;2:resveratrol;3:praziquantel;4:PBS. A: Flow cytometry of Th17 cells; B: Percentage of Th17 cells; C: Flow cytometry of Treg cells; D: Percentage of Treg cells.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsSEA group;△P<0.05vspraziquantel group.

2.5體外不同處理組Th17與Treg應答進一步采用體外實驗驗證，如Fig 4所示，與PBS處理組比較，SEA處理組、白藜蘆醇處理組、吡喹酮處理組Th17和Treg細胞的比例均明顯增高(P<0.05)。但是，白藜蘆醇處理組Th17細胞比例明顯低于SEA處理組和吡喹酮處理組(P<0.05)，而SEA處理組和吡喹酮處理組Th17細胞比例差異無顯著性(P>0.05)。同時，白藜蘆醇處理組Treg細胞比例明顯高于SEA處理組和吡喹酮處理組(P<0.05)，而SEA處理組和吡喹酮處理組Treg細胞比例差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

目前，血吸蟲病仍然在全球78個國家和地區(qū)廣泛流行，嚴重影響人類健康與生活。血吸蟲感染宿主后成蟲產卵，蟲卵分泌的SEA激活肝臟巨噬細胞，經過巨噬細胞加工處理，并呈遞給輔助性T淋巴細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)，誘導產生多種細胞因子及趨化因子等，從而募集大量巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、嗜酸粒細胞等，聚集到蟲卵周圍形成炎性肉芽腫，并繼發(fā)纖維化，導致嚴重的臨床癥狀，甚至死亡。其中，Th2細胞促進嗜酸性粒細胞的增殖、分化、募集至蟲卵周圍，促進肉芽腫形成發(fā)展；Th17細胞通過產生IL-17、CXCL1、CXCL2等，募集中性粒細胞至蟲卵周圍形成肉芽腫[2,4]。而Th1和Treg細胞則發(fā)揮抑制肉芽腫反應的作用，具體機制尚不清楚。因此，尋找調控Th應答的藥物成為防治血吸蟲病肝臟病理的重要策略。

本課題組已經證明，在血吸蟲感染過程中，白藜蘆醇可以通過調控Th1/Th2應答，發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。這表明白藜蘆醇在血吸蟲感染中也具有免疫調節(jié)的功能。有文獻報道，白藜蘆醇可通過下調Th17、上調Treg細胞應答，減輕潰瘍性結腸炎[9]。此外，白藜蘆醇還具有抑制趨化中性粒細胞的作用[10]。在血吸蟲感染過程中，白藜蘆醇能否通過調控Th17/Treg應答，發(fā)揮抗肉芽腫反應的作用？如果是，是否通過抑制中性粒細胞趨化形成蟲卵肉芽腫實現？本研究發(fā)現，經白藜蘆醇治療后，感染小鼠的肝臟肉芽腫反應明顯減輕，組成肉芽腫的中性粒細胞數量明顯減少，提示白藜蘆醇具有治療血吸蟲病肝臟肉芽腫的作用。這可能成為本課題組前期證明白藜蘆醇具有抗血吸蟲病肝纖維化的原因之一。探尋白藜蘆醇抗肝臟肉芽腫反應的機制發(fā)現，白藜蘆醇并不能減少血吸蟲感染后的成蟲數目和產卵數量，提示白藜蘆醇并不是與吡喹酮一樣具有殺蟲的作用，且對蟲卵沒有影響，因此，殺蟲不是白藜蘆醇抑制肝臟肉芽腫反應的原因。

本研究發(fā)現，經白藜蘆醇治療的血吸蟲感染小鼠中，組成肉芽腫的中性粒細胞明顯減少，結合文獻報道，Th17應答通過產生IL-17A、CXCL1、CXCL2等，趨化中性粒細胞形成肉芽腫的作用，檢測發(fā)現白藜蘆醇治療組Th17細胞比例明顯下調，肝臟中IL-17A、CXCL1、CXCL2表達也明顯下降，這些都與組成肉芽腫的中性粒細胞減少相一致。充分表明白藜蘆醇通過抑制Th17應答，減少中性粒細胞趨化形成肉芽腫。此外，大量研究表明，Th17/Treg細胞之間存在復雜的相關性，兩者在功能和分化過程中相互拮抗[11]。當炎癥發(fā)生時，可導致兩者失衡，引起一系列的免疫病理[12]。而在血吸蟲感染中，Th17和Treg應答恰對肝臟病理發(fā)揮相反的作用。本研究也發(fā)現，白藜蘆醇治療的血吸蟲感染小鼠Treg細胞比例上調，肝臟中Foxp3表達水平增高，這與減輕的肉芽腫反應相一致。上述的研究充分表明，白藜蘆醇可通過調控Th17/Treg應答，抑制血吸蟲病肝臟肉芽腫。

在血吸蟲感染的過程中，SEA刺激巨噬細胞分泌的IL-10和TGF-β可誘導Treg產生[13]。此外，巨噬細胞來源的IL-6、TGF-β、IL-21可誘導Th17的分化，其產生的IL-23維持Th17的產生[14]。而研究發(fā)現，在不同疾病中，白藜蘆醇可以通過直接調控巨噬細胞IL-6、IL-10、TGF-β等促炎或抑炎因子的表達，發(fā)揮治療作用[15]。提示白藜蘆醇可能通過直接調控巨噬細胞分泌因子的表達，介導Th17/Treg免疫應答的分化與功能，成為白藜蘆醇調控Th17/Treg應答，抑制血吸蟲病肝臟肉芽腫的具體機制,值得進一步探尋。在本研究中，還發(fā)現吡喹酮也能夠抑制血吸蟲肝臟肉芽腫反應，體內研究發(fā)現，吡喹酮能明顯抑制Th17應答，提示吡喹酮除了通過殺蟲和直接對肝臟作用發(fā)揮抗纖維化作用，也可能通過調控免疫應答如Th17，發(fā)揮抗肝臟肉芽腫的作用，但是，在體外SEA刺激實驗中，Th17應答并未發(fā)現與體內一樣的現象，分析吡喹酮可能是影響了血吸蟲其他的抗原介導的Th17應答，抑制肝臟肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，白藜蘆醇不僅可以通過調控Th1/Th2細胞應答，抑制血吸蟲病肝纖維化程度，同時還可以下調Th17應答，抑制中性粒細胞趨化，上調Treg應答，進而抑制血吸蟲病肝臟肉芽腫反應。但具體的調控機制還未得到合理解釋，有待進一步探尋。本研究為白藜蘆醇防治血吸蟲病和其他免疫相關疾病提供實驗依據。