鄭 婕，薛旻秋，權(quán)洪峰，王 銳，朱亞飛，景 晶，華 冰，彭曉東

(寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，寧夏顱腦疾病重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，生育力保持教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

應(yīng)激與多種神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)。慢性心理應(yīng)激(chronic psychological stress，CPS)不僅引起以行為、精神、情感、學(xué)習(xí)記憶異常等為表現(xiàn)的腦功能性損害，同時，還是諸多神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病病理生理變化的誘因[1]。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB)-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)信號通路是與神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病相關(guān)的信號調(diào)節(jié)通路[2]。研究顯示，應(yīng)激可導(dǎo)致CREB-BDNF通路失調(diào)，繼而引發(fā)抑郁樣行為和學(xué)習(xí)記憶障礙。因此，有學(xué)者推測，CREB-BDNF信號通路上調(diào)可能是改善應(yīng)激抑郁樣行為和認知障礙的重要靶點[2]。枸杞子(LyciumbarbarumL.)為茄科植物寧夏枸杞的成熟果實，作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材和重要經(jīng)濟作物，具有多種明確且高效的藥理活性，如神經(jīng)保護、生殖保護、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降血糖、降血脂、抗脂肪肝等[3]。枸杞籽油(Lycium barbarum seed oil，LBSO)是以枸杞的種子為原料，采用現(xiàn)代萃取技術(shù)獲得的富含多種生物功效的功能成分，含有不飽和脂肪酸、維生素E、卵磷脂、硒等多種生物功效的功能成分[4]。目前，有關(guān)LBSO的成份研究及其保健、藥理效應(yīng)的探討尚處于初步階段，LBSO是否對慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為和認知障礙具有改善作用？目前尚未見報道。本研究將基于CREB-BDNF信號通路，探討LBSO對慢性應(yīng)激的改善作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級♂ICR小鼠90只，體質(zhì)量(20±2)g，寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，醫(yī)學(xué)動物許可證號: SYXK(寧) 2011-0001。

1.1.2藥物與試劑 LBSO購于寧夏沃福百瑞枸杞產(chǎn)業(yè)股份有限公司，為枸杞籽超臨界CO2提取物；脂肪酸甲酯混標(Item No: CDAA-252795-MIX，Lot: 13260395，上海ANPEL)；鹽酸氟西汀分散片(fluoxetine，F(xiàn)lx)由Patheon France 生產(chǎn)，禮來蘇州制藥有限公司提供，用時采用生理鹽水配制成混懸液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。皮質(zhì)酮ELISA試劑盒、BDNF抗體，購自Abcam公司；抗CREB(48H2)、p-CREB(Ser133)(87G3)抗體，購自Cell Signaling公司。

1.1.3儀器 GCMS-QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)；Rxi-5Sil MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Restek)；BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)、Morris水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)及其工作站(成都泰盟科技)；JH-2張力換能器(中國北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；MultiskanTMGO酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；低溫高速離心機(Heal Force)；BX-51顯微鏡(日本Olympus)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media-Cybornetics)。

1.2方法

1.2.1LBSO中脂肪酸GC-MS成分分析

1.2.1.1 供試溶液制備 取LBSO約0.1g，精密稱定。依據(jù)藥典方法進行甲酯化反應(yīng)，得到供試檢測液。

1.2.1.2 氣質(zhì)聯(lián)用條件 GC條件：升溫程序為初始柱溫180 ℃，以3 ℃·min-1升至240 ℃，運行時間21.5 min；載氣(He)流速1.41 mL·min-1；壓力142.2 kPa，柱溫180 ℃，注射溫度260 ℃；進樣量1 μL ；分流比70 ∶1。MS條件：電子轟擊離子源；離子源溫度230 ℃；接口溫度300 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～500；檢測時間3.50～21.50 min。

1.2.1.3 分析結(jié)果 按GC-MS分析條件，取供試品溶液1.0 μL進樣，得LBSO甲酯化產(chǎn)物的總離子流(total ion current，TIC)圖。各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)對照脂肪酸甲酯混標，人工解析及NIST08、NIST08s數(shù)據(jù)庫檢索，按各色譜峰的質(zhì)譜碎片圖與文獻核對，對基峰質(zhì)荷比和相對豐度等方面進行直觀比較，鑒定各成分。同時采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以峰面積歸一化法計算LBSO中各組分的相對百分含量。

1.2.2動物實驗分組和給藥 90只♂ ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。隨機分為6組：正常組、模型組、氟西汀組及LBSO低、中、高劑量組，每組15只。除正常組群養(yǎng)外(5只/籠)，其余各組均采用單籠飼養(yǎng)(1只/籠)。LBSO低、中、高劑量組和氟西汀組每天灌胃給予LBSO 2.5、5.0、10.0 mL·kg-1及氟西汀20 mg·kg-1，正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，自造模d 1開始，至取材前1 d結(jié)束，持續(xù)35 d。

1.2.3建立慢性不可預(yù)見性刺激(chronically unpredicted stress，CUS)小鼠模型 參照文獻[5]，制備CUS小鼠模型。刺激方式包括：夾尾1 min，足底電擊5 min，4 ℃冰水游泳刺激5 min，噪音刺激10 min，束縛1 h，禁食禁水24 h，通宵照明，潮濕墊料，共8種不同刺激。為了實現(xiàn)刺激程序的不可預(yù)見性，每種刺激不在連續(xù)的2 d內(nèi)重復(fù)使用。正常組5只/籠飼養(yǎng)于被隔離的實驗室，除更換飼料、水和墊料外，不進行任何刺激。模型組、氟西汀組、LBSO低、中、高劑量組均在灌胃給藥1 h后，連續(xù)28 d進行CUS造模。整個實驗周期為35 d，于d 29開始進行行為學(xué)檢測，實驗流程圖見Fig 1。

Fig 1 Flow chart of experiment

1.2.4行為學(xué)檢測

1.2.4.1 曠場實驗(open field test，OFT) 參照本實驗室前期報道的建模方法[5]，將規(guī)格為30 cm×30 cm×30 cm的無蓋透明塑料箱放置在安靜房間中，方箱內(nèi)壁和底面涂白，底面均分為10 cm×10 cm的9個方格，攝像頭垂直在方箱中心上方約30 cm。保持實驗環(huán)境安靜，將小鼠放入方箱中心格內(nèi)，開始拍攝記錄6 min，統(tǒng)計小鼠后4 min內(nèi)水平移動格數(shù)(四肢均進入方格的穿越格數(shù))。為了避免殘留氣味對下一只小鼠的影響，每只小鼠實驗開始前均需要用低濃度酒精擦拭方箱，去除氣味。

1.2.4.2 懸尾實驗(tail suspension test，TST) 參照文獻及本實驗室前期報道的建模方法[5-6]，在安靜避光房間中，將小鼠垂直懸掛于50 cm×50 cm×50 cm的無蓋敞箱中，使小鼠鼻尖至紙箱底面約5 cm，并與JH-2張力換能器相連。自懸掛開始后，通過BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)記錄6 min張力換能器的受力變化，統(tǒng)計后4 min小鼠的不動時間。

1.2.5強迫游泳實驗(forced-swimming test，F(xiàn)ST) 參照本實驗室前期報道的建模方法[5]，保持實驗環(huán)境安靜，將小鼠放入直徑20 cm、高60 cm的保溫桶中，每缸加入(25±1) ℃、深30 cm的溫水，保證小鼠尾部無法觸碰保溫桶底部，上肢無法觸碰保溫桶上沿。自小鼠放入水中開始攝像記錄6 min，統(tǒng)計后4 min小鼠的不動時間(小鼠漂浮在水上保持固定姿勢超過2 s)。實驗時每桶1只動物，實驗完畢后，撈出的小鼠用熱燈烤干，且每只小鼠實驗前換水。

1.2.6Morris水迷宮實驗(Morris water maze test，MWMT) 參照文獻的方法并略有改進[7]。Morris水迷宮為直徑1 m，深60 cm的圓桶，加入(25±1) ℃、深約30 cm的不透明溫水，并在桶的E、N、W、S四個方向做好標記，作為小鼠入水點。實驗時，采用Morris 水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)及其工作站記錄并分析。

實驗分兩部分進行，第一部分空間記憶采集實驗用于檢測動物的學(xué)習(xí)和記憶獲得能力，于d 29～31進行。將直徑為3 cm的黑色平臺置于第三象限中央，每天每只小鼠分別從E、N、W、S 4個入水點背向平臺放入水池，記錄自放入水池至小鼠站上平臺的時間，即逃避潛伏期及游程。如果小鼠在90 s內(nèi)未站上平臺，將其引導(dǎo)至平臺上停留5 s，并記錄逃避潛伏期為90 s。第二部分空間探索實驗用于測量動物對平臺位置的記憶保持能力，于d 32進行。實驗時移除平臺，將小鼠從固定位置點放入水池，通過Morris水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)記錄小鼠90 s內(nèi)在原平臺所在區(qū)域內(nèi)穿行的次數(shù)，即原平臺有效穿越次數(shù)。記錄90 s內(nèi)小鼠的游泳路線，即空間探索實驗軌跡圖。每次實驗完成后，用熱燈將小鼠毛發(fā)烤干。

1.2.7CUS小鼠血清皮質(zhì)酮含量的檢測 行為學(xué)實驗全部完成后，禁食不禁水12 h，取材。小鼠腹腔注射4%水合氯醛10 mL·kg-1麻醉，待角膜反射消失后，摘眼球取血，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。依?jù)試劑盒要求進行檢測。

1.2.8Western blot檢測小鼠海馬組織內(nèi)BDNF、CREB、p-CREB蛋白表達 取血后，處死小鼠，打開顱腔取雙側(cè)海馬，液氮速凍后-80 ℃保存。檢測時，取凍存的海馬組織，提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。40 μg蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入BDNF(1 ∶400)、CREB(1 ∶1 000)、p-CREB(1 ∶1 000)及β-tubulin(1 ∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫封閉75 min后， TBST洗膜3次，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進行檢測分析，以 β-tubulin為內(nèi)參，校正 BDNF、CREB、p-CREB的蛋白表達，即蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/β-tubulin條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1LBSO中脂肪酸含量從LBSO樣品中共分離出5個組分，其中含量最高的是(Z)-9-十八碳烯酸，含量為66.40%，其次為反式-9,12-十八碳二烯酸，含量21.56%。另外，還含有十七酸、十八烯酸和反式-9-十八烯酸(Tab 1、Fig 2)。含量測定為本次實驗提供了較為詳細的LBSO脂肪酸組成。

2.2CUS應(yīng)激后小鼠行為表現(xiàn)及LBSO的干預(yù)作用如Fig 3所示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠曠場實驗運動得分明顯降低(P<0.01)；懸尾及強迫游泳不動時間明顯延長(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較， LBSO高劑量組明顯增加水平穿越格數(shù)(P<0.01)，LBSO低、高劑量組明顯縮短懸尾不動時間(P<0.05，P<0.01)，在強迫游泳實驗中，LBSO各劑量均能明顯縮短CUS小鼠的不動時間(P<0.01)。

Fig 2 Total ion chromatogram of full scan in LBSO by GC-MS

Fig 4的MWMT結(jié)果顯示，CUS小鼠不同程度地出現(xiàn)空間記憶能力損害。與對照組相比，模型組小鼠的逃逸潛伏期、平均潛伏距離明顯延長(P<0.05)，穿越原平臺有效次數(shù)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，LBSO高劑量組明顯縮短逃逸潛伏期，增加穿越原平臺有效次數(shù)(P<0.01)，LBSO低、高劑量組則縮短平均潛伏距離(P<0.05，P<0.01)。

2.3LBSO對CUS小鼠血清皮質(zhì)酮水平的抑制作用如Fig 5所示，與正常組相比，模型組小鼠的血清皮質(zhì)酮明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，LBSO高劑量組小鼠的血清皮質(zhì)酮低于模型組(P<0.05)。

2.4LBSO對CUS小鼠海馬組織中BDNF、CREB、p-CREB蛋白表達的影響如Fig 6所示，與正常組相比，模型組小鼠BDNF蛋白表達及p-CREB/CREB比值明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，LBSO高劑量組明顯上調(diào)CUS小鼠海馬p-CREB、BDNF蛋白表達(P<0.05，P<0.01)及p-CREB/CREB的比值(P<0.05)。提示LBSO能夠通過調(diào)節(jié)CREB-BDNF信號通路相關(guān)蛋白，減輕CUS引起的應(yīng)激損害。

3 討論

以中藥枸杞子的種子為原料，采用現(xiàn)代萃取技術(shù)獲得的富含多種生物功效成分的“枸杞籽超臨界CO2提取物”已經(jīng)成為替代傳統(tǒng)工藝獲得枸杞籽中油性成分的主要方法。雖然仍然稱其為枸杞籽油，但其工藝水平、無溶劑殘留、無污染的特性更加符合現(xiàn)代健康要求。研究表明，枸杞籽含油18%～22%，其中包含9種脂肪酸，亞油酸(C18:2)含 67.36%，其次是油酸(C18:1)和棕櫚酸(C16)，分別為7.12%、10.4%。此外，枸杞籽油中還含有維生素 A、D、E，K、Ca、Mg、Na、Fe等微量元素，磷脂、β-胡蘿卜素等[4]?；诙嗖伙柡椭舅嵩趹?yīng)激相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面發(fā)揮的重要作用[8]，本實驗以工業(yè)級枸杞籽超臨界CO2提取物為研究對象，采用GC-MS方法對其脂肪酸組成進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中含有的5個組分中以油酸(C18:1，68.32%)、亞油酸(C18:2，21.56%)及17酸(C17:0，5.82%)含量較高，此結(jié)果為LBSO后續(xù)功效學(xué)研究提供了必要的研究基礎(chǔ)。

Tab 1 Identification results of fatty acids from LBSO

Fig 3 LBSO relieved depressive symptoms in OFT，TST and

A:LBSO increased the line crossing in the OFT; B: LBSO decreased the immobility time in the TST; C: LBSO decreased the immobility time in the FST.#P<0.05，##P<0.01vsnormal;*P<0.05，**P<0.01vsmodel.

Fig 4 LBSO reversed CUS-induced spatial learning and memory damage in

A: The probe tracks of Probe Trials; B: LBSO decreased the escape latency in learning procedure; C: LBSO decreased the traveled distance in learning procedure; D: LBSO increased the frequency to enter the target zone in Probe Trials.#P<0.05，##P<0.01 vs normal;*P<0.05，**P<0.01vsmodel.

Fig 5 Effect of LBSO on serum corticosterone level

##P<0.01vsnormal;*P<0.05，**P<0.01vsmodel

慢性應(yīng)激與多種神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)。CUS動物模型是重要的慢性心理應(yīng)激模型，被用于抗抑郁活性成分篩選、學(xué)習(xí)記憶研究及諸多神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的機制研究[9-10]。本次實驗經(jīng)過28 d連續(xù)刺激，建立小鼠CUS模型，同時給予LBSO治療，治療后通過曠場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗，評價LBSO對CUS小鼠抑郁樣行為的改善作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUS小鼠的水平穿越格數(shù)明顯減少，懸尾及強迫游泳不動時間明顯延長，這些行為學(xué)指標說明CUS小鼠的活動度明顯降低，對陌生環(huán)境的探究興趣喪失，對絕望環(huán)境的逃脫意識明顯減弱，CUS小鼠出現(xiàn)了抑郁樣行為，模型建立成功。 LBSO干預(yù)后，CUS小鼠的行為學(xué)指標得到明顯改善，表現(xiàn)為水平穿越格數(shù)明顯增加，懸尾及強迫游泳不動時間明顯縮短，提示LBSO能明顯改善CUS小鼠的抑郁樣行為。

Fig 6 LBSO treatment restores the CREB-BDNF signaling

#P<0.05，##P<0.01vsnormal;*P<0.05，**P<0.01vsmodel.

海馬在情緒行為調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶保持與調(diào)控方面發(fā)揮重要的作用，海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷是慢性應(yīng)激所致認知障礙、學(xué)習(xí)記憶能力降低的首要原因[11]。Morris 水迷宮是一種研究與海馬功能相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型，可較為準確地反映受試動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[2,7]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUS小鼠在Morris 水迷宮實驗中的逃逸潛伏期明顯延長，平均潛伏距離增加，穿越原平臺有效次數(shù)明顯減少，說明CUS小鼠出現(xiàn)了認知及學(xué)習(xí)記憶能力障礙。LBSO干預(yù)后，能夠明顯縮短逃逸潛伏期和平均潛伏距離，增加CUS小鼠穿越原平臺次數(shù)，提示LBSO能明顯改善CUS小鼠的認知功能障礙及學(xué)習(xí)記憶能力降低。

研究表明，慢性應(yīng)激動物下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)處于持續(xù)的激活狀態(tài)，血清皮質(zhì)酮升高，從而產(chǎn)生高皮質(zhì)酮血癥，抑制HPA軸負反饋調(diào)節(jié)，造成海馬等部位神經(jīng)元代謝與功能障礙，進而引發(fā)多種抑郁樣反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LBSO可以明顯降低由CUS誘導(dǎo)的血清皮質(zhì)酮水平升高。提示LBSO能逆轉(zhuǎn)CUS引起的HPA軸受損反饋調(diào)節(jié)，可能與其改善CUS小鼠的抑郁行為和認知功能障礙有關(guān)。

CREB介導(dǎo)BDNF的產(chǎn)生，CREB-BDNF信號通路是目前研究最為活躍的、與神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病相關(guān)的信號調(diào)節(jié)通路[2,13]。BDNF與應(yīng)激導(dǎo)致的認知障礙和抑郁樣行為有關(guān)，而且BDNF在慢性應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁癥及其并發(fā)癥的診治中發(fā)揮重要作用的同時，在學(xué)習(xí)記憶過程中同樣扮演重要的角色[13-14]。學(xué)者普遍認為，調(diào)節(jié)BDNF分泌的上游蛋白CREB也與應(yīng)激引起的病理學(xué)改變有關(guān)[15]。CREB既是BDNF的上游信號蛋白，也是從短期記憶鞏固至長期記憶的關(guān)鍵蛋白，并在認知障礙的發(fā)病機制中起重要作用[2,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，LBSO能上調(diào)CUS小鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白表達及p-CREB/CREB的比值，提示上調(diào)應(yīng)激小鼠海馬內(nèi)CREB-BDNF信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，可能是LBSO產(chǎn)生改善CUS小鼠的抑郁行為和認知功能障礙的關(guān)鍵機制。

本研究以枸杞籽超臨界CO2提取物為研究對象，通過建立小鼠慢性應(yīng)激模型，研究得出枸杞籽超臨界CO2提取物可以改善慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為和認知障礙，并上調(diào)應(yīng)激小鼠海馬CREB-BDNF信號通路關(guān)鍵蛋白的表達。實驗結(jié)果為寧夏道地藥材枸杞子的經(jīng)濟開發(fā)提供了新的科學(xué)依據(jù)。

(致謝: 本實驗在寧夏醫(yī)科大學(xué)中心實驗室完成，衷心感謝實驗中心各位老師在整個實驗過程中的悉心指導(dǎo)和耐心幫助。)