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        13-甲基十四烷酸對大鼠腦缺血后腦水腫的影響

        2019-01-04 08:43:38陳世妹張文榮
        中國藥理學(xué)通報(bào) 2019年1期
        關(guān)鍵詞:腦水腫腦缺血腦組織

        馮 曉,陳世妹,張文榮

        (1. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院思明分院大內(nèi)科,福建 廈門 361000;2. 廈門市社會福利中心,福建 廈門 361000;3. 三明醫(yī)學(xué)科技職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建 三明 365000)

        惡性腦缺血中風(fēng)在腦血管疾病中以高死亡率(80%)和嚴(yán)重臨床癥狀為特點(diǎn),而缺血后腦水腫的形成使神經(jīng)功能損傷加速惡化,顱內(nèi)壓升高,腦血流量減少,最終導(dǎo)致腦疝和病人死亡[1]。然而腦缺血后腦水腫發(fā)生的機(jī)制尚不十分清楚,因此,目前臨床治療僅限于對癥處理?,F(xiàn)有研究認(rèn)為,腦缺血后腦水腫的發(fā)生機(jī)制有腦微循環(huán)障礙、腦能量代謝障礙、血腦屏障(blood brain barrier,BBB)障礙、自由基增加、鈣超載、膜分子結(jié)構(gòu)紊亂等學(xué)說。腦缺血后造成BBB 結(jié)構(gòu)的完整性破壞,使其通透性增加,引發(fā)腦水腫,導(dǎo)致BBB進(jìn)一步破壞,擴(kuò)大腦梗死體積,造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷,這是缺血性腦損傷的重要病理基礎(chǔ)[2]。13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid, 13-MTD)是一種末端支鏈飽和脂肪酸,天然存在于細(xì)菌和某些真菌的細(xì)胞膜上,是細(xì)菌胞膜的重要成分[3]。13-MTD被首次發(fā)現(xiàn)存在于Bacillus subtilis菌屬胞膜的脂肪酸組成成分中,有維持膜的流動(dòng)性和膜功能作用。13-MTD作為細(xì)胞膜成分能嵌入膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中,可通過調(diào)節(jié)膜的組成而影響細(xì)胞功能,在脂質(zhì)雙分子層中脂肪酸含量較高時(shí),對哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜有膜穩(wěn)定作用。然而,13-MTD對腦缺血后大鼠BBB是否也具有膜穩(wěn)定作用,從而抑制腦缺血后腦水腫的形成,進(jìn)而抑制大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷尚不清楚。本研究擬通過觀察13-MTD對大鼠腦缺血后腦水腫的形成和BBB功能改變相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,從水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)角度探討其機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley (SD)大鼠,♂,體質(zhì)量230~270 g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

        1.1.2試劑 13-MTD由廈門大學(xué)藥學(xué)院合成,濃度10 g·L-1,以脂質(zhì)體包裹;伊文思藍(lán)(Evan’s blue, EB),廈門泰京生物技術(shù)有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC),分析純,上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn),用PBS配制成2% TTC工作液,4 ℃避光保存;AQP4多克隆抗體(H-19),Santa Cruz公司;SABC-羊抗兔IgG試劑盒,武漢博士德公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成;TRIzol,Invitrogen公司;免疫組化試劑盒,福州邁新。

        1.1.3儀器 光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司);LGR16-W型低溫高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);超低溫冰箱(日本SANYO);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene Genius公司);9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)。

        1.2制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型線栓法制備大鼠MCAO模型[4-5]。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h,自由飲水。10%水合氯醛0.3 mL·kg-1腹腔麻醉,仰臥固定后頸部酒精消毒,正中切口約3 cm,分離兩側(cè)甲狀腺,暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū),鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,并小心分離迷走神經(jīng)。分離頸外動(dòng)脈分支甲狀腺上動(dòng)脈,頸內(nèi)動(dòng)脈分支枕動(dòng)脈,分別電凝。充分游離頸外動(dòng)脈,將頸外動(dòng)脈吊線,在距離頸總動(dòng)脈分叉大約1 cm處結(jié)扎近心端,電凝遠(yuǎn)心端。用無創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端,將頸外動(dòng)脈殘端牽向外下方,使之與頸內(nèi)動(dòng)脈呈一條直線,在頸外動(dòng)脈殘端距頸總動(dòng)脈分支約3 mm處剪一小口,將栓線自頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈,將栓線與血管稍作結(jié)扎防止血液溢出,打開頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾,輕柔緩慢的將栓線向前推進(jìn)約(18.5±0.5)mm(自分叉處計(jì)),遇阻力時(shí)即停止進(jìn)線,再次將栓線與頸外動(dòng)脈共同結(jié)扎以固定栓線,松開頸總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾,縫合切口。此時(shí)封閉了大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)開口,阻斷了MCA的血流,制成MCAO模型。動(dòng)物在手術(shù)中及手術(shù)后注意保溫。模型成功的標(biāo)志為,動(dòng)物清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱和行走時(shí)的追尾癥。

        1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、空白脂質(zhì)體對照組(Vehicle)、13-MTD 40、80、120 mg·kg-1組(M40、M80、M120)。按缺血時(shí)間分為6、12、24 h組,即Sham-6、12、24 h組,Veh-6、12、24 h組,M40-6、12、24 h組,M80-6、12、24 h組,M120-6、12、24 h組,每組5只。Sham組除不插入線栓,其它相同。插入栓線前30 min分別尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的13-MTD 40、80、120 mg·kg-1,Vehicle組給予等體積空白脂質(zhì)體。各組大鼠均于相應(yīng)缺血時(shí)間處死取材。

        1.4神經(jīng)功能缺失評分參照Longa等[6]建立的神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn),判斷模型是否成功。0分:無明顯神經(jīng)缺損癥狀,活動(dòng)正常;1分:垂直提起時(shí)不能完全伸展對側(cè)前肢(輕度局灶性神經(jīng)功能缺損);2分:行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺損);3分:行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒(重度局灶性神經(jīng)功能缺損);4分:不能自發(fā)行走或有意識障礙。缺血術(shù)后評1~3分者為手術(shù)成功的標(biāo)志,手術(shù)中出血過多的動(dòng)物棄去。

        1.5腦梗死體積測定于相應(yīng)的缺血時(shí)間迅速斷頭取腦,將腦組織置于生理鹽水冰盤上去除嗅球、小腦和低位腦干,冠狀切片,每片厚約2 mm。切4刀,成5片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處;第2刀在視交叉部位;第3刀在漏斗柄部位;第4刀在漏斗柄與葉尾極之間。迅速將腦片置2% TTC磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中避光染色,37 ℃溫孵30 min,其間每隔7~8 min翻動(dòng)1次。溫孵完畢后,將腦片置10%福爾馬林中避光保存過夜。將固定后的染色結(jié)果拍照輸入計(jì)算機(jī),利用AutoCAD圖像處理軟件求出梗死區(qū)域(白色)占大腦總體積的百分比(梗死灶體積不包括其周邊的的缺血半暗帶),以此作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

        1.6腦水腫測定

        1.6.1AutoCAD軟件測定腦水腫程度 于相應(yīng)缺血時(shí)間,處死大鼠,迅速取出腦組織,切成等厚度的5片腦冠狀切片拍照后輸入計(jì)算機(jī),利用圖像處理軟件AutoCAD,計(jì)算損傷側(cè)腦水腫程度:腦水腫=(損傷側(cè)腦半球體積-非損傷側(cè)腦半球體積)/非損傷側(cè)腦半球體積×100%[7]。

        1.6.2腦干濕重測定腦含水量 于相應(yīng)缺血時(shí)間,處死大鼠,迅速取出腦組織,切成等厚度的5片,準(zhǔn)確稱量濕重后,將腦片放入烤箱內(nèi)110 ℃烤24 h,將腦片烤至恒重,取出稱量腦片干重。公式:腦水腫=(濕重-干重)/ 濕重×100%[7]。

        1.7腦組織EB含量測定BBB通透性EB是一種常用的腦血管通透性指示劑,正常情況下EB與血清白蛋白結(jié)合而不能通過BBB。BBB受損時(shí),EB-白蛋白可通過內(nèi)皮細(xì)胞的吞飲作用或經(jīng)細(xì)胞間隙,從血管內(nèi)進(jìn)入腦組織。因此,通過計(jì)算腦組織EB的含量可以了解BBB的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)觀察MCAO各缺血時(shí)間點(diǎn),各組大鼠腦組織EB的滲出情況,并計(jì)算其含量。于處死時(shí)間點(diǎn),以10%水合氯醛半量麻醉動(dòng)物后將線栓取出,從尾靜脈注射2% EB 2 mL·kg-1,幾秒鐘后,大鼠眼球結(jié)膜、四肢等處顯示藍(lán)色,表示注入成功。用生理鹽水250 mL從左心室灌注沖洗直至流出清亮液體,迅速斷頭取腦,在電子分析天平上稱濕重,損傷側(cè)置于裝有3 mL甲酰胺的勻漿器進(jìn)行勻漿,54 ℃水浴孵育24 h后,3 000 r·min-1離心30 min,取200 μL上清置于96孔板,用酶標(biāo)儀(λ=630 nm)測定各組的光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出EB含量,依據(jù)所測得濃度計(jì)算出BBB對EB的通透率,以每克濕重腦組織內(nèi)所含EB的量(mg·kg-1)來表示。

        1.8RT-PCR檢測腦組織AQP4mRNA表達(dá)取凍存于-80 ℃冰箱的各組腦組織,取腦皮層處100 mg組織液氮研磨,TRIzol法提取總 RNA,TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。AQP4引物:256 bp,上游引物:5′-AGAACCAAGGCGTAAACCG-3′,下游引物:5′-TCCCTGGAAATGACTGAGAAA-3′;β-actin:698 bp,上游引物:5′-ACCTCCAACACCCCAGCCATG-3′,下游引物:5′-CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3′。取1 μL cDNA 進(jìn)行 PCR 反應(yīng), 反應(yīng)條件: 94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,28個(gè)循環(huán); 循環(huán)后均72 ℃終延伸7 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片,用圖像處理軟件 Phoretix 1D分析目標(biāo)條帶的灰度值。

        1.9免疫組化檢測腦組織AQP4蛋白表達(dá)腦組織常規(guī)制備石蠟切片,58 ℃~60 ℃烤片1 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,抗原修復(fù),3% H2O2室溫孵育10 min,PBS沖洗,正常山羊血清封閉10 min,一抗4 ℃過夜,PBS沖洗,加入二抗,37 ℃孵育10 min,PBS沖洗,加入SP復(fù)合物孵育10 min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。使用同等對比度和曝光時(shí)間,在40×10倍普通顯微鏡下觀察并拍照。

        2 結(jié)果

        2.113-MTD對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的影響各組大鼠于腦缺血6、12、24 h時(shí)分別處死,并進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分比較。如Fig 1所示,Sham組評0分,不同缺血時(shí)間組均有不同程度的神經(jīng)功能缺失癥狀,表現(xiàn)為右側(cè)眼瞼下垂,提尾懸空時(shí)左前肢內(nèi)收及軀干向左側(cè)扭轉(zhuǎn),運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈式行走為追尾征,神經(jīng)功能缺失嚴(yán)重時(shí)向左側(cè)傾倒,各缺血時(shí)段神經(jīng)功能評分有明顯差異(P<0.05);與Vehicle組比較,13-MTD 40、80、120 mg·kg-1均可降低各缺血時(shí)段的神經(jīng)功能缺失評分(P<0.05),且存在劑量依賴性(P<0.05),以M80組改善最為明顯(P<0.05)。

        Fig 1 Effect of 13-MTD on neurological deficit score in different groups after 6, 12 and 24 h MCAO in rats n=6)

        #P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

        2.213-MTD對大鼠腦缺血后腦梗死面積的影響如Fig 2所示,各缺血時(shí)間Sham組切片經(jīng)2% TTC染色后腦片全紅,色澤均勻;Vehicle組、缺血6 h損傷側(cè)腦組織尚可色澤度,整體完整,切片經(jīng)2% TTC染色后,缺血側(cè)腦片可見皮層部分有白色梗死灶,缺血12 h組白色梗死灶明顯,累及整個(gè)缺血側(cè)的大腦皮層,缺血24 h組白色梗死灶最為明顯,可累及到整個(gè)缺血側(cè)腦半球,并伴有輕度的糜爛;13-MTD 40、80、120 mg·kg-1組損傷側(cè)腦組織外觀均有所改善,白色梗死灶范圍均有所減少(P<0.05),尤其以M80組治療效果最好(P<0.05),各劑量組間存在劑量依賴性(P<0.05)。

        2.313-MTD對大鼠腦缺血后腦水腫的影響

        2.3.113-MTD對大鼠腦缺血后腦組織體積的影響 如Fig 3所示,各缺血時(shí)間Sham組大腦體積均勻;Vehicle組兩側(cè)腦組織體積不均等,缺血側(cè)腦組織體積稍大,與Sham組比較水腫明顯(P<0.05);與Vehicle組相比, M40、M80、M120組腦組織水腫減輕(P<0.05),以M80組效果最好(P<0.05),各劑量組之間差異有顯著性(P<0.05)。

        2.3.213-MTD對大鼠腦缺血腦組織含水量的影響 如Fig 4所示,與Sham組比較,各缺血時(shí)間Vehicle組腦組織含水量明顯增加(P<0.05)。與Vehicle組相比,M40、M80、M120組腦組織含水量均明顯下降(P<0.05),并有量效差異,以M80組效果最好(P<0.05)。

        2.413-MTD對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響如Fig 5所示,與Sham組比較,各缺血時(shí)間Vehicle組可見明顯的藍(lán)色區(qū)域(P<0.01)。與Vehicle相比,M40、M80、M120組損傷腦EB滲出明顯減少(P<0.05),以M80組效果最好,并有量效差異(P<0.05)。

        2.513-MTD對大鼠腦缺血后AQP4表達(dá)的影響Fig 6的RT-PCR結(jié)果顯示,腦缺血12 h后,Sham組有極少量的AQP4 mRNA表達(dá),Vehicle組腦組織

        Fig 2 Comparison effect of 13-MTD on infarct size in different groups after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

        #P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

        Fig 3 Effect of 13-MTD on cerebral edema in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

        #P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

        AQP4 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),M40、M80組均可使腦組織AQP4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05),各劑量之間差異有顯著性(P<0.05),以M80組效果最好。

        Fig 7的免疫組化結(jié)果顯示,腦內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)呈陽性的細(xì)胞,胞膜上呈均勻分布的棕黃色顆粒。

        Fig 4 Effect of 13-MTD on dry and wet weight in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=5)

        *P<0.05vssham;#P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

        AQP4蛋白主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞(astroglia,AST)胞膜上。Sham組有少量AQP4表達(dá);Veh-6、12、24 h組AQP4表達(dá)升高;M80-6、12、24 h組AQP4蛋白表達(dá)下降。

        3 討論

        腦缺血后腦水腫的發(fā)生主要涉及兩個(gè)類型:細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。細(xì)胞毒性腦水腫產(chǎn)生于腦缺氧或者是水中毒,腦細(xì)胞缺氧后能量代謝發(fā)生障礙,故不能維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,使水和離子進(jìn)入細(xì)胞而產(chǎn)生腦水腫。細(xì)胞膜Na+的主動(dòng)遷移過程依賴于Na+,K+-ATP酶(鈉泵),對細(xì)胞容量起到維持作用,任何影響三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)代謝的化合物都會導(dǎo)致鈉泵的調(diào)節(jié)障礙,使Na+和水內(nèi)流,細(xì)胞發(fā)生腫脹[8]。Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡也是細(xì)胞毒性腦水腫的重要原因,亦可使細(xì)胞腫脹和死亡,Ca2+濃度升高可激活磷脂酶類,促進(jìn)膜磷脂的分解,使細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)受損[9]。血管源性腦水腫主要是BBB受損,導(dǎo)致水分子由血管內(nèi)向細(xì)胞外間隙移動(dòng),與血管通透性增高有關(guān),水腫液為富含血漿蛋白的血漿濾液。其在白質(zhì)是細(xì)胞外間隙擴(kuò)大,在灰質(zhì)則是細(xì)胞容積增大,細(xì)胞組分中變化最突出的是星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST),AST有明顯的胞飲現(xiàn)象。過去認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中信息的整合與傳遞是由神經(jīng)元承擔(dān)的,膠質(zhì)細(xì)胞只是起到被動(dòng)的輔助角色,但近來研究發(fā)現(xiàn),AST在神經(jīng)系統(tǒng)中不僅是支持、提供營養(yǎng)及代謝等作用,其在神經(jīng)元的保護(hù)、BBB的形成、疼痛機(jī)制的調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮著積極作用,并參與免疫功能和神經(jīng)干細(xì)胞功能[10]。腦缺血發(fā)生早期,缺血區(qū)域毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍的AST、神經(jīng)元開始腫脹,隨著缺血時(shí)間延長,AST上的AQP4大量表達(dá),使AST持續(xù)腫脹,并引起B(yǎng)BB的破壞和毛細(xì)血管通透性的增加[11-12]。腦缺血后腦水腫發(fā)生時(shí),MAPK信號通路激活能夠誘導(dǎo)AQP4表達(dá)[13]。研究發(fā)現(xiàn),13-MTD可作為細(xì)胞膜成分嵌入膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中,通過調(diào)節(jié)膜的組成而抑制MAPK信號激活[14]。

        Fig 5 Effect of 13-MTD on EB in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

        *P<0.05vssham; #P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

        Fig 6 Change of ratio of AQP4/β-actin mRNA in different groups after MCAO 12h in rats n=6)

        *P<0.001vssham;#P<0.01vsvehicle;△P<0.01vsM40

        Fig 7 Comparison of expression of AQP4 protein in cerebral cortex detected by immunohistochemistry after MCAO 6, 12 and 24 h in rats (×400)

        A : Sham-6 h; B: Veh-6 h; C: M80-6 h; D: Sham-12 h; E: Veh-12 h; F: M80-12 h; G: Sham-24 h; H: Veh-24 h; I: M80-24 h.

        本實(shí)驗(yàn)采用MCAO模型復(fù)制大鼠局灶性腦缺血6、12、24 h,證實(shí)13-MTD 40、80、120 mg·kg-1尾靜脈給藥可明顯減輕各時(shí)段MCAO后的腦損傷,以腦缺血12 h以內(nèi)的保護(hù)作用最好,各時(shí)段均以M80組改善更好,13-MTD能夠抑制大鼠腦缺血后腦水腫的形成。同時(shí)我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),13-MTD的保護(hù)作用與腦內(nèi)AQP4表達(dá)相關(guān)。其機(jī)制可能與13-MTD抑制MAPK信號激活,進(jìn)而下調(diào)腦內(nèi)AST中AQP4基因和蛋白表達(dá),改善細(xì)胞性腦水腫有關(guān)。

        (致謝:感謝廈門大學(xué)藥學(xué)院、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供的實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)支持!)

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