賈雪凌，范玉華，潘 昱，方 坤，趙寶山，王 麟，陳紅陽，蔣雅楠，宋印利

[哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室、2. 藥學(xué)院生物技術(shù)制藥教研室，黑龍江 大慶 163319]

白藜蘆醇(resveratrol, Rev)是一類天然多酚化合物，主要存在于葡萄、紅酒和傳統(tǒng)藥材虎杖的根中。研究發(fā)現(xiàn)，Rev具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等作用[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是引發(fā)心血管疾病的主要原因，Rev具有良好的抗AS作用。眾所周知，Rev可以多靶點(diǎn)改善內(nèi)皮功能障礙，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞的形成，以及減少脂質(zhì)堆積等，發(fā)揮預(yù)防和治療AS的作用[1]。

AS是一類以炎性浸潤(rùn)和脂質(zhì)積聚為特征的慢性炎癥性疾病，其中，動(dòng)脈壁中持續(xù)的巨噬細(xì)胞積聚是發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。人們發(fā)現(xiàn)，在患者動(dòng)脈斑塊中存在著大量的巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞是由內(nèi)膜中單核細(xì)胞分化而來的，通過分泌促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-1β、TNF-α)，吸收膽固醇、脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，以及引發(fā)細(xì)胞凋亡等，促進(jìn)AS斑塊的形成、發(fā)展和破裂[2-3]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)是一類由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，且缺乏蛋白編碼能力的內(nèi)源性非編碼RNA。過去，人們認(rèn)為lncRNAs是轉(zhuǎn)錄過程中的“噪音”，近年來發(fā)現(xiàn)它在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的意義。人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript1, MALAT1)是目前研究最為深入的一種高度豐富和保守的lncRNAs，其長(zhǎng)度約為8 000 nt，定位于染色體11q13[4]。據(jù)報(bào)道，MALAT1參與多種心血管疾病的病理生理過程[5-6]。Han等[7]發(fā)現(xiàn)，MALAT1在糖尿病AS大鼠的巨噬細(xì)胞中表達(dá)增高，提示MALAT1與AS密切相關(guān)。盡管有研究表明，氧化型低密度脂蛋白可通過促進(jìn)MALAT1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)攝取[8]，但MALAT1在AS中的確切作用機(jī)制仍尚不明確，有待進(jìn)一步研究。由于Rev的潛在抗動(dòng)脈硬化作用，以及MALAT1參與糖尿病AS發(fā)生發(fā)展過程，因此，本研究旨在探討Rev調(diào)控MALAT1發(fā)揮抗AS作用的機(jī)制，并闡明MALAT1在AS中的潛在作用，為指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡ApoE-/-小鼠，♂，體質(zhì)量(27±3)g，購自南京君科生物工程有限公司[SCXK(蘇)2016-0010]。所用動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度(23±1) ℃，濕度55%～60%，可自由攝食飲水。ApoE-/-小鼠12只，隨機(jī)分為ApoE-/-高脂飲食(high fat diet, HFD)組和ApoE-/-高脂飲食加Rev(10 mg·kg-1)組，每組6只，高脂組和Rev組分別給予高脂飲食飼養(yǎng)16周。高脂飼料含78.85%基礎(chǔ)飼料、0.15%膽固醇、21%脂肪。16周后，每組取6只小鼠，異戊烷吸入麻醉下，取血管及心臟，-80 ℃或4%多聚甲醛固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2藥物與試劑 Rev購自美國(guó)Sigma公司，稱取Rev粉末，溶于DMSO中，配制成終濃度為100 mmol·L-1的Rev儲(chǔ)存液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?；脂多?lipopolysaccharides, LPS)、游離膽固醇(free cholesterol, FC)、巰基乙酸培養(yǎng)基(thioglycollate medium)，均購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、引物購自TaKaRa公司； MALAT1干擾RNA(siMALAT1-1、siMALAT1-2、siMALAT1-3)及陰性對(duì)照(siNC)由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.1.3儀器 Eppendorf 5430R高速離心機(jī)、Eppendorf-flexlid梯度PCR儀(德國(guó)艾本德公司)；NanDrop One核算蛋白定量?jī)x(美國(guó)賽默飛世爾公司)；Sunrisere Tecan光吸收酶標(biāo)儀(奧地利帝肯公司)；H-7650日立透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2方法

1.2.1巨噬細(xì)胞的提取與分離 正常C57BL6小鼠腹腔注射3%巰基乙酸肉湯，4 d后通過腹膜灌洗法獲得腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清，含100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。4 h后，將非貼壁細(xì)胞洗去，并將腹腔巨噬細(xì)胞孵育在含有10%胎牛血清和20% L929上清的DMEM培養(yǎng)液中2 d，每天更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2HE染色法 將不同處理組心臟取出，4%多聚甲醛固定過夜，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。主動(dòng)脈竇的石蠟切片蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min，鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗1 min，伊紅30 s，自來水沖洗1 min，80%乙醇30 s，90%乙醇30 s，100%乙醇3 min，二甲苯10 min，中性樹脂封片。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞 通過藥物或轉(zhuǎn)染試劑處理后，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物分別進(jìn)行MALAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α及GAPDH的擴(kuò)增，采用PCR儀運(yùn)行此實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)循環(huán)為40個(gè)。MALAT1引物序列為上游： 5′-CCCCAGCTTTTCCAGAATCC-3′，下游：5′-GCATCAAGGTGAGGGGTGAA-3′；IL-6引物序列為上游：5′-GGCGGATCGGATGTTGTGAT-3′，下游：5′-GGACCCCAGACAATCGGTTG-3′；IL-1β引物序列為上游：5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′，下游5′-ATCTTTTGGGGTCCG TCAACT-3′；TNF-α引物序列為上游：5′-GGAACACGTCGTGGGATAATG-3′，下游5′-GGCAGACTTTGGATGCTTCTT-3′；GAPDH引物序列為上游：5′-AGTGGCAAAGTGGAGATT-3′，下游5′-GTGGAGTCATACTGGAACA-3′。

1.2.4電鏡觀察 取模型組斑塊組織及給藥處理組斑塊處，用2.5%戊二醛固定30 min后，制成超薄切片，在1萬倍下采取20個(gè)視野，隨機(jī)選取7處。電子顯微鏡下觀察斑塊中泡沫細(xì)胞形成及數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1Rev減少泡沫細(xì)胞縮小動(dòng)脈斑塊Fig 1A結(jié)果顯示，連續(xù)給予Rev能夠明顯降低動(dòng)脈血管壁及主動(dòng)脈弓斑塊的形成。HE染色結(jié)果表明，給予Rev 16周能夠明顯降低主動(dòng)脈根部動(dòng)脈斑塊面積(Fig 1B)。進(jìn)一步采用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Rev處理組能夠明顯降低泡沫細(xì)胞的形成(Fig 1C)。

2.2Rev劑量依賴性地上調(diào)MALAT1的表達(dá)水平我們進(jìn)一步研究Rev是否通過調(diào)控MALAT1，進(jìn)而發(fā)揮抗AS作用。Fig 2A結(jié)果表明，Rev(1、3、5 μmol·L-1)處理腹腔巨噬細(xì)胞24h，能夠劑量依賴性地上調(diào)MALAT1的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rev對(duì)MALAT1表達(dá)的作用，采用real time PCR檢測(cè)Rev(3 μmol·L-1)分別處理12、24、48 h后MALAT1的表達(dá)。Fig 2B結(jié)果顯示，Rev處理12 h對(duì)MALAT1 mRNA表達(dá)影響不明顯，處理24 h MALAT1 mRNA表達(dá)明顯增加，處理48 h MALAT1 mRNA無法繼續(xù)上調(diào)。可見，Rev對(duì)MALAT1調(diào)控作用不是時(shí)間依賴性，提示Rev可能部分通過調(diào)控MALAT1表達(dá)發(fā)揮抗AS作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1在AS中的作用，我們采用real time PCR檢測(cè)動(dòng)脈斑塊中MALAT1表達(dá)水平。結(jié)果顯示，給予HFD的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊中MALAT1 mRNA水平明顯下調(diào)。此外，Rev明顯逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的ApoE-/-小鼠斑塊中MALAT1 mRNA的下調(diào)(Fig 2C)?？梢?，MALAT1參與AS發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

2.3Rev抑制IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞給予Rev刺激24 h后，100 μg·L-1LPS刺激3 h，采用real time PCR檢測(cè)Rev對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。Tab 1結(jié)果表明，LPS能夠顯著刺激IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)，而Rev能明顯降低IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)。

Fig 1 Rev attenuatedformation of atherosclerosis plaques in ApoE-/- mice

A:Representative aorta preparations of the total aorta treated with Rev(10 mg·kg-1) or without Rev in ApoE-/-mice fed a HFD diet for 16 weeks; B: Representative histological analysis of cross-sections of the aortic sinus(scale bar: 400 μm); C:Macrophage-derived foam cells were filled with abundant lipid droplets.

Tab 1 Effects of Rev on mRNA levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in n=6)

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsLPS

2.4下調(diào)MALAT1促進(jìn)IL-6、TNF-αmRNA的表達(dá)巨噬細(xì)胞給予siMALAT1(1-3)或陰性對(duì)照(NC)處理36 h后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同處理組對(duì)MALAT1表達(dá)的影響。Fig 3A結(jié)果表明，siMALAT1-3能夠明顯降低MALAT1 mRNA表達(dá)。繼續(xù)選用siMALAT1-3孵育細(xì)胞36 h后，給予100 μg·L-1LPS刺激3h，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)siMALAT1-3對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。Fig 3B結(jié)果表明，siMALAT1-3孵育36 h能明顯促進(jìn)IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)。

2.5FC刺激巨噬細(xì)胞MALAT1表達(dá)下調(diào)FC(10 mg·L-1)刺激巨噬細(xì)胞3、6、12 h，F(xiàn)ig 4結(jié)果表明，F(xiàn)C刺激3、6h能夠明顯降低MALAT1 mRNA表達(dá)。提示Rev可能通過調(diào)控膽固醇，進(jìn)而影響MALAT1表達(dá)，從而調(diào)控炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)，發(fā)揮抗AS作用。

3 討論

心血管疾病是導(dǎo)致人類高死亡率的主要病因。長(zhǎng)期以來，天然產(chǎn)品廣泛用于預(yù)防和治療包括心血管疾病在內(nèi)的慢性疾病。Rev作為研究最多的膳食天然產(chǎn)品之一，已顯示出對(duì)多種疾病具有保護(hù)作用。然而，Rev在AS中的保護(hù)作用及潛在機(jī)制尚未完全清楚。最近研究表明，Rev可以減少三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide,TMAO)誘導(dǎo)的AS鼠的主動(dòng)脈斑塊面積[9]。此外，Chang等[10]發(fā)現(xiàn)，HFD誘導(dǎo)的AS鼠中，每天給予高劑量Rev(25mg·kg-1)8周，可以明顯降低低密度脂蛋白膽固醇和IL-6水平。

本研究結(jié)果表明，每天給予Rev(10mg·kg-1)16周，能夠明顯降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓部及根部斑塊的面積和泡沫細(xì)胞的數(shù)量。Arslan等[11]發(fā)現(xiàn)，MALAT1在AS斑塊中表達(dá)減少，這與我們的結(jié)果是一致的。在本研究中，腹腔巨噬細(xì)胞給予Rev后，發(fā)現(xiàn)MALAT1的表達(dá)量升高，且這種升高具有劑量依賴性，通過進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1在AS中的作用，我們發(fā)現(xiàn)Rev明顯逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的ApoE-/-小鼠斑塊中MALAT1的下調(diào)。進(jìn)一步研究表明，Rev能夠抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)。Tang等[12]發(fā)現(xiàn)，MALAT1具有抗炎作用，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化型低密度脂蛋白損傷。Zhao等[13]的研究表明，MALAT1參與調(diào)節(jié)先天免疫和炎癥反應(yīng)，敲低MALAT1會(huì)增加LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的表達(dá)。因此，我們假設(shè)MALAT1可能通過調(diào)控炎癥來發(fā)揮抗AS作用。與我們預(yù)期相一致的是，在腹腔巨噬細(xì)胞中敲降MALAT1后，qPCR結(jié)果顯示能夠明顯增加LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。雖然本研究并沒有發(fā)現(xiàn)敲低MALAT1對(duì)IL-1β有明顯的抑制作用，但是Rev對(duì)MALAT1的調(diào)控，以及MALAT1對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用已明確，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rev對(duì)炎癥因子IL-6和TNF-α同樣具有調(diào)控作用。因此，我們推斷Rev抗AS作用部分通過調(diào)控MALAT1。

Fig 2 Effects of Rev on expression of lncRNA

A:Rev could reduce the level of MALAT1 in a dose-dependent manner; B: Rev could increase expression of MALAT1 at the 24 h incubation; C: MALAT1 decreased in HFD diet in ApoE-/-mice, while Rev could elevate the level of MALAT1 in HFD diet in ApoE-/-mice.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05vsHFD group.

Fig 3 Effects of MALAT1 on mRNA expressionof IL-6 and TNF-α in

A:siMALAT1-3 could significantly decrease the level of MALAT1; B:The mRNA levels of IL-6 and TNF-α were dominantly elevated by treatment with siMALAT1-3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

膽固醇是AS病變中的主要成分，過多的膽固醇可使巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的大量積聚可形成脂質(zhì)條紋和斑塊。因此，巨噬細(xì)胞中膽固醇的平衡流動(dòng)是避免脂質(zhì)積累和控制AS發(fā)展所必需的。Voloshyna等[14]研究表明，Rev可通過上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCA1、ABCG1、SR-BI)的表達(dá)，減少THP-1巨噬細(xì)胞中的游離膽固醇和膽固醇酯含量。此外，Rev也可通過降低血漿極低密度脂蛋白水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的膽固醇流出[15]。本實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)C刺激腹腔巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)MALAT1的表達(dá)明顯下降。本研究表明，Rev能夠抑制AS發(fā)生發(fā)展，且Rev可能通過調(diào)控MALAT1及膽固醇發(fā)揮抗AS的作用。但Rev是通過直接還是間接調(diào)控MALAT1，發(fā)揮抗AS作用并未證明，且未深入探討MALAT1下游調(diào)控的潛在靶點(diǎn)。因此，我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)全面地闡明MALAT1的作用機(jī)制，以及Rev對(duì)MALAT1的調(diào)控機(jī)制。

Fig 4 Effects of cholesterol on

*P<0.05vsnormal group

總之，本實(shí)驗(yàn)部分揭示了Rev可能部分通過調(diào)控MALAT1，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)來發(fā)揮抗AS作用。此外，本研究結(jié)果表明，Rev可能通過調(diào)控FC，進(jìn)而調(diào)控MALAT1表達(dá)發(fā)揮抗AS作用。然而，我們?nèi)孕枰罅繉?shí)驗(yàn)證實(shí)Rev確切作用及MALAT1的作用機(jī)制。

[致謝：本實(shí)驗(yàn)是在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)檢驗(yàn)中心完成，感謝課題組成員對(duì)實(shí)驗(yàn)的幫助！]