丁淑梅，張 杰，邱紅梅，黃 波，吳 芹，蔣青松

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003)

糖尿病是臨床最常見的慢性疾病之一，常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的重要原因。DN病理改變包括腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化、蛋白尿大量增加等[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族，包括α、β、γ 3種受體亞型，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝、抗炎、抗纖維化等作用，其選擇性激動劑已用于臨床相關(guān)疾病的治療[2]。PPARs的3種亞型在腎臟均有表達(dá)[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PPARα受體激動劑非洛貝特可使糖尿病患者的蛋白尿減少，改善糖尿病腎損傷[4]；PPARγ激動劑噻唑烷酮類對DN足細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，從而改善腎功能，減少蛋白尿[5]。而PPARβ的研究相對較少，目前無選擇性PPARβ激動劑上市。苯扎貝特(bezafibrate，BEZ)是目前唯一上市的PPARs泛激動劑，對PPARα、PPARβ和PPARγ都有激活作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，BEZ也能減少DN患者的微量白蛋白尿[7]。目前，BEZ主要用于血脂紊亂的治療，而對于其在DN的保護(hù)作用及可能機(jī)制研究較少。

20-羥-二十烷四烯酸(20-hydroxy eicosatetraenoic acid，20-HETE)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)ω-羥化酶途徑經(jīng)細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)4A/4F催化生成的代謝產(chǎn)物，對正常生理功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，參與多種疾病的病理過程[8]，如糖尿病、心血管疾病、腫瘤等。近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARs的作用與20-HETE有關(guān)。在DN大鼠的腎小球，PPARα受體激動劑氯貝特可上調(diào)CYP4A表達(dá)，增加20-HETE而產(chǎn)生腎保護(hù)作用[9]。在DOCA-鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型，另一個(gè)PPARα受體激動藥非洛貝特也可以上調(diào)CYP4A表達(dá)，增加20-HETE而產(chǎn)生降壓作用[10]。那么，在糖尿病引起的腎臟損傷中，BEZ的作用是否也與CYP4A-20-HETE的變化有關(guān)？目前國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬利用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立糖尿病模型，以尿素氮(urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿白蛋白、腎臟病理變化為DN形成指標(biāo)，觀察BEZ對DN的保護(hù)作用，以及20-HETE的變化情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡清潔級♂昆明小鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。

1.1.2試劑 BEZ購自Sigma公司(純度98%，用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液)，批號：BCBK4044V；STZ購自Sigma公司，批號：WXBC2544V；兔抗CYP4A、PPARα、PPARβ、PPARγ多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體，均購自美國Protein Tech公司；小鼠20-HETE ELISA檢測試劑盒，購自上海江萊生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 AU5811全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；ONETOUCH Ultra血糖儀(美國強(qiáng)生公司)；Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1DN模型的建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用高糖高脂飲食喂養(yǎng)4 周，腹腔注射STZ(溶于pH 4.5的檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)用現(xiàn)配)40 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d。7 d后，用血糖儀測空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。從40只小鼠中選取FBG≥11.1 mmol·L-1小鼠30只，繼續(xù)給予高糖高脂飲食4 周。隨機(jī)選擇10只小鼠處死進(jìn)行病理學(xué)檢測，證實(shí)DN改變，提示DN模型形成，即為DN模型組。其余糖尿病小鼠隨機(jī)分成2組(每組10只)，分別為，DN形成4 周組(DN4W)：給予等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液；BEZ組(BEZ)：BEZ 75 mg·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)4周。正常對照組(NC)：另取小鼠10只，給予正常飼料喂養(yǎng)4周，連續(xù)5 d腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖溶液，7 d后測血糖值，然后繼續(xù)用正常飼料飼養(yǎng)4周后，灌胃給予等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液4周。

每周檢測小鼠的FBG，并用代謝籠收集尿液(檢測尿液體積和尿白蛋白含量)。給藥4周后，眼眶取血，處死小鼠。立即取出腎臟并稱重。計(jì)算腎臟指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)。分裝標(biāo)本，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2腎功能指標(biāo)檢測 將血液分裝后，室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r · min-1離心15 min，取血清凍存于-80 ℃冰箱備用。尿液于4 ℃、3 000 r · min-1離心15 min，取上清凍存于-80 ℃冰箱備用。用自動生化分析儀檢測Scr、BUN和尿白蛋白的水平。

1.2.3Masson染色 腎臟組織置于4%的多聚甲醛中固定24 h，75%乙醇脫水，石蠟包埋，制作組織切片。用Masson染色進(jìn)行病理學(xué)檢查。使用Image J 1.43軟件測量腎小球橫斷面面積(glomerular cross-sectional area，GA)，計(jì)算平均腎小球體積(glomerular volume，GV)。每只小鼠取20個(gè)腎小球的面積，計(jì)算GV：GV=β/κ×GA3/2，其中β=1.38，為球體形狀系數(shù)；κ=1.1，為粒徑分布系數(shù)。每組取5只小鼠。

1.2.4透射電鏡 用冷刀片切取0.5 mm3腎組織置于4%的戊二醛固定液中，4 ℃固定2 h，用PBS清洗3次，后經(jīng)1%的四氧化鋨固定2 h，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合、切片，醋酸鈾和拘椽酸鉛雙重染色，置于透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測腎臟組織PPARα、PPARβ、PPARγ、CYP4A蛋白的表達(dá) 稱取50 mg腎臟組織，加入0.5 mL RIPA裂解液，4 ℃勻漿。于4 ℃、12 000×g離心15 min，提取腎臟組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為40 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗GAPDH (1 ∶2 000)、CYP4A (1 ∶1 000)、PPARα (1 ∶1 000)、PPARβ (1 ∶1 000)、PPARγ (1 ∶1 000)，4 ℃過夜；TBST 洗膜，5 min×3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜后加ECL發(fā)光試劑顯影，采用Image Lab 4.1進(jìn)行檢測分析，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度/GAPDH條帶灰度，每組重復(fù)3次。

1.2.6ELISA檢測20-HETE含量 按照試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于450 nm波長檢測各樣品OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清20-HETE的水平。

2 結(jié)果

2.1BEZ對DN小鼠FBG的影響如Fig 1所示，給予STZ 7 d后，DN小鼠 FBG升高至(19.98 ± 2.21) mmol·L-1(P<0.01)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，DN小鼠的FBG維持在較高的水平。BEZ給藥FBG水平略有下降(P<0.05)，但仍遠(yuǎn)高于11.1 mmol·L-1的糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2BEZ對DN小鼠腎功能的影響如Tab 1所示，糖尿病形成4周后，模型小鼠BUN、Scr、尿白蛋白明顯升高(P<0.01)，且尿白蛋白比正常組高23.22倍，提示糖尿病小鼠出現(xiàn)了DN。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即DN形成4 周后，模型小鼠BUN、Scr、尿白蛋白升高更加明顯(P<0.01)，尿白蛋白比正常組增加36.21倍，提示模型小鼠DN加重。BEZ治療給藥4周后，使糖尿病小鼠上述指標(biāo)水平明顯下降(P<0.01)，尿白蛋白降低了71.02%。

Fig 1 Effect of bezafibrate on FBG level in mice

*P<0.05，**P<0.01vsDN4W

Tab 1 Effect of bezafibrate on BUN，SCr and urinary albumin

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W.

2.3BEZ對DN小鼠腎臟病理的影響與正常組比較，糖尿病形成4周后，小鼠腎臟指數(shù)(Fig 2C)、腎小球體積(Fig 2D)明顯增大(P<0.01)；Masson染色可見，腎小球中出現(xiàn)膠原纖維、腎小管擴(kuò)張、空泡變性(Fig 2A)；電鏡檢查可見，小鼠腎臟基底膜不均勻增厚、足突部分融合、系膜基質(zhì)增加(Fig 2B)。上述病理改變提示DN形成。DN形成4周后，小鼠腎臟指數(shù)(Fig 2C)、腎小球體積(Fig 2D)進(jìn)一步增大(P<0.01)；腎小球中出現(xiàn)大量膠原纖維，相互交聯(lián)成網(wǎng)，細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維增生，腎小管擴(kuò)張，空泡變性明顯(Fig 2A)；小鼠腎臟基底膜局部增厚或變薄，微血管瘤形成，足突消失溶解，系膜基質(zhì)增加(Fig 2B)。BEZ給藥4周后，與DN4W組比較，小鼠的腎臟肥大(P<0.01)、膠原纖維增生、腎小管擴(kuò)張、空泡變性、基底膜增厚等病理明顯改善。

2.4BEZ對DN小鼠PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常組比較，DN4W小鼠腎臟PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表達(dá)分別減少了31.77%、26.09%、38.71%(P<0.01)；BEZ給藥則使其分別增加了0.27、0.15、0.27倍 (P<0.01)。

Fig 2 Effect of bezafibrate on pathological changes of kidney tissues in mice with diabetic

A: Masson staining (×400); B: Transmission electron microscopic examination (×10 000); C: Kidney index; D: Glomerular volume.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W.

Fig 3 Effect of bezafibrate on PPARα，PPARβ，PPARγ protein expression of kidney in mice with diabetic

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W

2.5BEZ對DN小鼠CYP4A蛋白表達(dá)和血清中20-HETE的影響如Fig 4所示，與正常組比較，DN4W小鼠腎臟CYP4A蛋白表達(dá)減少了32.00%(P<0.01)，血清20-HETE的含量降低了29.89%(P<0.01)；BEZ給藥則使二者分別增加了0.21倍和0.26倍(P<0.01)。

3 討論

DN是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，目前仍然缺乏有效的預(yù)防和治療措施。臨床研究表明，BEZ能減少DN患者微量白蛋白尿[7]；聯(lián)合小劑量螺內(nèi)酯治療，BEZ除了降低DN患者血脂水平外，也使尿白蛋白大幅度下降[11]。本研究利用高糖高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)形成糖尿病4周后，糖尿病小鼠的BUN、Scr和尿白蛋白均升高，且尿白蛋白高出正常組10倍以上，達(dá)到糖尿病并發(fā)癥聯(lián)盟網(wǎng)站(AMDCC)所提出的DN動物模型建立標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)，模型小鼠出現(xiàn)腎臟肥大、膠原纖維增加、基底膜不均勻增厚、足突部分融合等病理改變。腎臟結(jié)構(gòu)和功能檢測結(jié)果均提示，糖尿病小鼠出現(xiàn)明顯腎臟損傷，DN模型建立。BEZ治療給藥4周，明顯改善DN小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的受損，延緩DN小鼠的腎臟損傷。另外，給予BEZ治療后，DN小鼠的FBG雖然有所降低，但仍遠(yuǎn)大于11.1 mmol·L-1的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示BEZ雖然能一定程度降低血糖水平，但對血糖的控制不是其產(chǎn)生腎臟保護(hù)作用的根本原因。

Fig 4 Effect of bezafibrate on CYP4A protein expression of kidney (A) and 20-HETE levels in serum (B)

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W

目前，對于BEZ作用的研究仍然主要集中于PPARs受體的激動，尤其是PPARα受體激動后對血脂異常及相關(guān)疾病的改善。本研究結(jié)果也顯示，BEZ使DN小鼠腎臟組織PPARα、PPARβ和PPARγ蛋白表達(dá)均上調(diào)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，PPARs的作用可能與激活20-HETE有關(guān)[9-10]。20-HETE是AA CYP氧化酶途徑代謝產(chǎn)物之一。AA代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有重要的生理及病理作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖、凝血及纖溶系統(tǒng)動態(tài)平衡、體溫及血壓等相關(guān)過程。過去研究認(rèn)為，AA主要經(jīng)環(huán)氧酶途徑和脂氧酶途徑代謝，分別產(chǎn)生前列腺素及白三烯類物質(zhì)，發(fā)揮其對炎癥及代謝等的調(diào)控作用。近十余年研究發(fā)現(xiàn)，AA的“第三條代謝途徑”——CYP氧化酶途徑產(chǎn)物環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)和20-HETE在正常生理狀態(tài)的維持和病理過程的進(jìn)展中也具有重要作用[8]。

20-HETE在腎臟高度表達(dá)[12]。在糖尿病的離體和整體模型，其腎臟的微粒體、近端腎小管上皮中CYP4A表達(dá)和20-HETE生成增加，抑制20-HETE的生成對DN有保護(hù)作用[13-14]。但也有相反的研究結(jié)果。在DN大鼠的腎臟及腎小球，CYP4A表達(dá)和20-HETE產(chǎn)生減少；給予內(nèi)源性和外源性的20-HETE對腎小球通透性屏障有保護(hù)作用，減輕蛋白尿，延緩腎纖維化的進(jìn)程[9,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與后者一致，在高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)DN模型，腎臟組織CYP4A表達(dá)下調(diào)，20-HETE產(chǎn)生減少。給予BEZ治療4周后，糖尿病腎損傷改善同時(shí)，CYP4A上調(diào)，20-HETE增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CYP4A-20-HETE的活化可能參與了BEZ對糖尿病腎損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，BEZ對DN小鼠的腎損傷有保護(hù)作用，該作用的發(fā)生可能與BEZ上調(diào)CYP4A表達(dá)，增加20-HETE含量有關(guān)。由于DN參與因素的復(fù)雜性和BEZ作用的廣泛性，BEZ對DN保護(hù)作用的參與機(jī)制仍需要進(jìn)行更深入研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！)