張輝，白晨，張惠忠，李曉東，付增娟，趙尚敏，鄂圓圓，張自強(qiáng)，王良，張必周

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031）

0 引言

甜菜作為重要的糖料作物，分布在全世界除大洋洲和南極洲外的其他大陸約43個(gè)國家和地區(qū)。世界上甜菜種植面積大約能占到糖料作物的40%。叢根病是影響甜菜生產(chǎn)的重要病害，能導(dǎo)致甜菜的產(chǎn)量和含糖率嚴(yán)重下降。因此在選育品種過程中，品種的叢根病抗性是很重要的指標(biāo)。上世紀(jì)自發(fā)生甜菜叢根病以來，國內(nèi)科技人員對(duì)甜菜叢根病進(jìn)行了積極的研究，近幾年雖引進(jìn)HYB-74等一些叢根病抗性新品種[1]，選育了農(nóng)大甜研6號(hào)[2]、ZT-6[3]和XJT9907[4]抗耐叢根病甜菜品種，但總體對(duì)甜菜叢根病的基礎(chǔ)性研究相對(duì)不足，遠(yuǎn)沒有國外活躍[5-6]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子手段輔助常規(guī)育種已經(jīng)成為育種研究工作的一項(xiàng)新手段。因此本文概述了近年來利用分子方法對(duì)叢根病致病機(jī)理及相關(guān)抗性研究的較新進(jìn)展，以期為我國甜菜叢根病的深入研究、快速發(fā)展提供參考和借鑒。

1 甜菜叢根病類型及發(fā)病機(jī)理研究

1.1 甜菜叢根病類型研究進(jìn)展

甜菜叢根病是一種由甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）引起的嚴(yán)重甜菜病害。這種病害是由甜菜多粘菌通過土壤傳播的，現(xiàn)在許多甜菜種植的國家都有發(fā)現(xiàn)，是甜菜產(chǎn)業(yè)在全球范圍面臨的嚴(yán)重危害。Chiba等在全球范圍的BNYVV分離菌株中發(fā)現(xiàn)了不同類型的基因序列變異，這些基因變異分別發(fā)生在RNA3-p25、RNA4-p31、RNA2-CP和RNA5-p26，其中RNA3-p25基因編碼的致病因子是病毒產(chǎn)生致病性的關(guān)鍵因素。在意大利發(fā)現(xiàn)的BNYVV分離菌株中p25具有最強(qiáng)的陽性選擇，能夠不同程度地克服宿主的Rz1抗性基因，而其他地域的分離菌株則不能克服抗性基因的影響，不發(fā)病。p25蛋白第67位和第68位的氨基酸的變異會(huì)導(dǎo)致致病性發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，BNYVV病毒最初是在東亞地區(qū)發(fā)生進(jìn)化，近年來已成為栽培甜菜品種的病原體，進(jìn)而形成了新的抗性突變體[7]。多粘菌是許多作物病毒傳播的介質(zhì)。Laufer等研究了BNYVV和甜菜土傳花葉病毒（BSBMV）熒光標(biāo)記技術(shù)在煙草共侵染和重疊侵染試驗(yàn)中的應(yīng)用。共侵染實(shí)驗(yàn)表明，在接種后，同一種和不同種Benyvirus的不同標(biāo)記種群在空間上是分離的。采用差異標(biāo)記技術(shù)對(duì)煙草脆裂病毒（TRV）進(jìn)行聯(lián)合感染，獲得了相同的觀察結(jié)果。在BNYVV和BSBMV的復(fù)合侵染試驗(yàn)中，二者不能在其先前感染BNYVV或BSBMV的植株中建立二次侵染[8]。Galein等采用大量田間取樣和室內(nèi)試驗(yàn)相結(jié)合的方法。以不同類型抗性甜菜品種為材料，對(duì)BNYVV多樣性的進(jìn)化進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從1 000多個(gè)野生樣品中，證實(shí)了不同A、B和P型BNYVV的同時(shí)存在，在p25四分體的67～70位鑒定了21個(gè)變異體。第一種變體AYHR最常見，其次是SYHG。大量混合感染（占樣本的9.93%），大多為B型和P型，也已得到證實(shí)。與A型或B型相關(guān)的四分體也與已知的RNA5基因組相關(guān)聯(lián)，從而使BNYVV對(duì)甜菜根具有更強(qiáng)的侵略性。具有Rz1和Rz2抗性基因的品種，即使BNYVV效價(jià)較高，也沒有表現(xiàn)出明顯的根部癥狀。盡管BNYVV的RNA 3序列具有較廣的多樣性，但這些品種在生長季末土壤中的病毒侵染潛力也較低。Rz1和Rz2品種的甜菜土傳病毒（BSBV）也較低。在田間感染線蟲的品種中，Rz1和抗病基因的BNYVV滴度均低于Rz1或同時(shí)具有Rz1和Rz2的品種。而且法國甜菜的BNYVV的群體類型往往不同于世界其他地區(qū)[9]。關(guān)于BNYVV在中國的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的信息卻相對(duì)較少。Zhuo等對(duì)中國4個(gè)基因組區(qū)（CP、RNA3、RNA4和RNA5）的BNYVV分離株進(jìn)行了測序，通過序列比較分析發(fā)現(xiàn)不同基因型和p25的四分體結(jié)構(gòu)異變體一起混合組成的這幾種病毒分離株。在中國BNYVV病毒群體總共發(fā)現(xiàn)了12種不同類型的p25四分體，其中有4種是之前未見報(bào)道的?；?個(gè)基因（CP、RNA3-p25、RNA4-p31和RNA5-p26）的系統(tǒng)發(fā)育分析揭示中國地區(qū)存在2～4個(gè)類群。從p25和p26株中國分離株中分別鑒定出兩個(gè)新亞組和一個(gè)新類群。篩選壓力分析表明，中國分離株的p25存在正選擇壓力，而其他3種蛋白則處于負(fù)選擇壓力下。不同省份的BNYVV種群間存在著頻繁的基因流動(dòng)，這意味著不同省份的BNYVV種群沒有地理上的差異[10]。

1.2 叢根病檢測方法研究進(jìn)展

目前BNYVV的檢測方法有很多，其中比較常用的有表型鑒定法、解剖學(xué)鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附法以及RT-PCR法。酶聯(lián)免疫吸附法和RT-PCR法在實(shí)際試驗(yàn)中應(yīng)用較多，目前以酶聯(lián)免疫吸附法為基礎(chǔ)又衍生出效果更佳的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（DAS-ELISA）。Mehrvar和Decro?s等分別利用RT-PCR方法對(duì)不同地區(qū)和不同類型的叢根病病毒進(jìn)行檢測，對(duì)不同類型叢根病病毒進(jìn)行了分類研究[11-12]。國內(nèi)劉大麗等利用RT-PCR技術(shù)檢測BNYVV病毒，在待檢測的甜菜塊根中檢測到了324 bp的叢根病病毒片段[13]。Uhde-Holzem等開發(fā)了特異性單克隆抗體方法檢測BNYVV病毒，對(duì)以病毒樣品顆粒（VLPs）作為合成抗原的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了相關(guān)評(píng)價(jià)[14]。Yardimci等開發(fā)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法（DAS-ELISA），在土耳其的主要甜菜種植區(qū)檢測BNYVV病毒，并比較了RT-PCR法和DAS-ELISA法的檢測效果，發(fā)現(xiàn)RT-PCR法比較適用于BNYVV的檢測[15]。Almasi等開發(fā)一種新型BNYVV檢測方法，通過逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）方法鑒定BNYVV病毒[16]。Nouayti等比較了幾種不同甜菜根部BNYVV根病病毒RNA檢測方法，發(fā)現(xiàn)采用氯化鋰技術(shù)、工業(yè)試劑盒、直接和膜點(diǎn)滴粗提法提取的RNA與其它方法相比，具有較高的純度和較高的RNA濃度。此6種方法，氯化鋰技術(shù)和瓊脂試劑盒是檢測BNYVV前從甜菜樣品中提取病毒RNA最合適的方法[17]。目前隨著各種新技術(shù)的發(fā)展，眾多新型的方法被用于BNYVV病毒的檢測中。

1.3 叢根病的發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展

甜菜壞死黃脈病毒基因組由1～5正鏈RNA組成，病毒RNA1和RNA2編碼的基因及復(fù)制，與蛋白組裝和細(xì)胞移動(dòng)有關(guān)。RNAl包含6 746個(gè)核苷酸，有1個(gè)開放閱讀框，編碼p237蛋白自身催化切割成兩個(gè)蛋白（p66和p150），其中p66包括全部的聚合酶，而p150蛋白包含甲基轉(zhuǎn)移酶、解旋酶和類木瓜蛋白酶。RNA2含有 4 612 個(gè)核苷酸，它編碼 6 個(gè)蛋白：運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）p13、p15 及 p42，外殼蛋白（CP）p21，通讀蛋白（RT）p75和1個(gè)具有調(diào)控功能的蛋白p14[18]。Chiba等對(duì)BNYVV和BSBMV中富含半胱氨酸的p14蛋白的RNA沉默抑制特性開展了相關(guān)研究工作。發(fā)現(xiàn)病毒的p14蛋白與其他病毒致病因子是彼此獨(dú)立的，一般聚集在核仁和細(xì)胞質(zhì)中。而BNYVV VSR表達(dá)則與長距離運(yùn)動(dòng)之間存在一定的相關(guān)性[19]。p13、p15和p42這3種運(yùn)動(dòng)蛋白相互作用促進(jìn)RNA細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)，其中p42能夠和RNA或者DNA捆綁到一起，將病毒包住，而p13和P15可以為p42病毒復(fù)合體于胞間連絲處提供一個(gè)停泊位點(diǎn)，通過改變胞間連絲的大小，從而使病毒RNA在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞[20-21]。

RNA3包括1 775個(gè)核苷酸，從N端起編碼3個(gè)不同的蛋白：P25蛋白、N蛋白（59個(gè)氨基酸）和1個(gè)4.6 kDa蛋白，RNA3的存在可以使病毒通過載體傳遞的效率更高[22]。Flobinus等發(fā)現(xiàn)BNYVV在甜菜中的系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)依賴于病毒RNA3，RNA3含有20個(gè)核苷酸組成的核心蛋白基序，這些對(duì)于穩(wěn)定非編碼RNA3（ncRNA3）和在物種間的長距離運(yùn)動(dòng)起著重要作用[23]。Peltier等研究發(fā)現(xiàn)BNYVV RNA3在非寄主轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中表達(dá)時(shí)，并不積累35 S啟動(dòng)子。而在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行的瞬時(shí)表達(dá)中發(fā)現(xiàn)了一種3′-衍生物。這3′-衍生物的物種類似于以前報(bào)道的在病毒感染期間產(chǎn)生的亞基因組RNA3[24]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)BNYVV RNA3的內(nèi)源缺失突變體是在系統(tǒng)感染過程中自發(fā)產(chǎn)生的，內(nèi)源缺失并不影響RNA3的有效復(fù)制，但可提高RNA3在系統(tǒng)宿主中的穩(wěn)定性和致病性[25]。Flobinus等發(fā)現(xiàn)BNYVV非編碼RNA的產(chǎn)生依賴于5′→3′Xrn外顯子酶的活性。野生型或突變型RNA3在釀酒酵母中的表達(dá)有利于ncRNA3種的積累。對(duì)釀酒酵母核糖核酸酶突變體的篩選表明，5′→3′外顯子酶Xrn1是RNA3加工過程中的關(guān)鍵酶，在體外和昆蟲細(xì)胞提取物中都進(jìn)行了重組。Xrn1以類似黃病毒Xrn1抗性結(jié)構(gòu)（sfRNA）的方式在含有ncRNA3的RNA底物上停滯。用sfRNA序列替代BNYVV RNA3核心序列，可使酵母中ncRNA在體外積累，而不是在植物中積累，且無病毒長距離發(fā)生。有趣的是，Xrn4基因的敲除減少了BNYVV RNA的積累，表明核糖核酸酶在病毒循環(huán)中具有雙重作用[26]。Kozlowska-Makulska等利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）技術(shù)驗(yàn)證RNA3的功能[27]。Bornemann等發(fā)現(xiàn)p25蛋白特異性突變的Rb株會(huì)影響到抗病性。野生型（WT）和Rb特性的種群通過p25深度測序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分析種群的p25變異水平與Rb性質(zhì)無關(guān)[28]。Thiel H等對(duì)BNYVV致病因子p25與含有未知功能F盒家族蛋白（FBK）的甜菜蛋白相互作用展開了研究，證實(shí)了甜菜FBK-p25在體內(nèi)和體外的相互作用，通過酵母雙雜交橋聯(lián)試驗(yàn)，證實(shí)了p25對(duì)ASK1蛋白SCF復(fù)合物的直接作用，研究結(jié)果支持了p25參與甜菜病毒致病性的觀點(diǎn)[29]。Peltier等將p25蛋白轉(zhuǎn)染到模式生物擬南芥中，通過Southern雜交對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定，篩選出攜帶轉(zhuǎn)基因單拷貝和多拷貝的獨(dú)立株系。發(fā)現(xiàn)其對(duì)BNYVV感染不敏感，但在表達(dá)p25蛋白的植株上出現(xiàn)了不正常的分歧現(xiàn)象[30]。Thiel和Acosta-Leal等也對(duì)RNA3的p25蛋白開展了一系列研究，發(fā)現(xiàn)p25可以進(jìn)入到宿主細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而可以引起宿主葉片發(fā)生嚴(yán)重的壞死反應(yīng)[31-32]。

RNA4含有兩個(gè)開放閱讀框，其中一個(gè)開放閱讀框編碼多粘菌傳遞病毒不可缺少的p31蛋白[33]。Fan等利用聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）分析，將RNA4編碼p31蛋白融合到紅色熒光蛋白（RFP），發(fā)現(xiàn)RNA4引起的重度癥狀可能與p31轉(zhuǎn)錄修飾有關(guān)。BNYVV的RNA4表達(dá)過程中的RNA沉默基因表達(dá)的修飾，泛素-蛋白酶體途徑、纖維素的合成，以及內(nèi)源赤霉素代謝可能有助于引發(fā)嚴(yán)重癥狀表現(xiàn)[34]。Wu等發(fā)現(xiàn)在BNYVV感染過程中，只有整個(gè)p31才能誘導(dǎo)PR-10上調(diào)，富含半胱氨酸的p31中的所有色氨酸和6個(gè)半胱氨酸（C174、C183、C186、C190、C197和C199）對(duì)PR-10的表達(dá)有顯著影響，這與BNYVV感染的巴氏桿菌嚴(yán)重癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)[35]。RNA5有一個(gè)開放閱讀框，編碼p26蛋白，不是所有RNA病毒都有的[18]。McGrann等研究了BNYVV的組成，RNA5僅限于亞洲和歐洲的某些地區(qū)，而且這些分離物往往更具有侵略性[36]。還有相關(guān)報(bào)道在日本、中國和法國的分離物中發(fā)現(xiàn)該類型。一般含有RNA5的病毒較僅含有RNA1～4的病毒，被認(rèn)為能引起更嚴(yán)重的病害[18，37]。

2 甜菜叢根病分子輔助育種研究

2.1 甜菜基因工程研究進(jìn)展

近年來基因工程在各種作物上都有大量應(yīng)用，在甜菜上也有迅速的發(fā)展。Jahromi等克隆了BNYVV的主要外殼蛋白 （CP21），并在大腸桿菌中表達(dá)，從PCR擴(kuò)增的免疫球蛋白庫中構(gòu)建噬菌體抗體庫，對(duì)重組CP21抗原進(jìn)行了4輪篩選，獲得了幾條特異性單鏈FV片段，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定[38]。Acosta-Leal等探討B(tài)NYVV群體的遺傳寄主效應(yīng)，將野生型病毒的分離物接種到具有部分抗性的基因Rz1、Rz2以及感病的甜菜品種中，并且克隆了病毒RNA3部分序列，發(fā)現(xiàn)病毒的多樣性與宿主的抗性強(qiáng)度成正比[39]。PavliO I分別于2011和2012年利用轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)甜菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)獲得的轉(zhuǎn)化植株對(duì)甜菜叢根病具有一定的抗性[40-41]。Delbianco等利用農(nóng)桿菌接種的方法將含有全長cDNA病毒基因組拷貝質(zhì)粒的懸浮農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，通過cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒基因組的拷貝RNA，從而引發(fā)感染[42]。Jiang等建立了花椰菜花葉病毒35 S啟動(dòng)子控制下的BNYVV全長感染性cDNA克隆。進(jìn)一步開發(fā)了一套基于BNYVV的載體，可在模式植物和甜菜植株中高效表達(dá)4種重組蛋白，其中包括一些長度可達(dá)880個(gè)氨基酸的大蛋白。這些載體可用于研究系統(tǒng)侵染植物葉片、根和莖組織中多種蛋白的亞細(xì)胞共定位。此外，以BNYVV為載體的NBPDS引導(dǎo)RNA在表達(dá)CaS 9的轉(zhuǎn)基因植株上進(jìn)行基因組編輯，基于BNYVV的載體將促進(jìn)甜菜和相關(guān)植物中多種蛋白質(zhì)的基因組研究和表達(dá)[43]。Laufer等開展了BSBMV和BNYVV cDNA克隆的生物學(xué)特性研究，通過等溫體外重組，構(gòu)建了適合兩種病毒基因組接種的載體。發(fā)現(xiàn)BNYVV和BSBMV的RNA1、RNA2重組子能進(jìn)行長距離傳播[44]。

國內(nèi)將分子方法應(yīng)用于甜菜育種中也較為普遍。劉大麗等利用基因克隆的方法對(duì)兩類真菌抗性基因At Chitinase1和At Glucanase2的功能域進(jìn)行了克隆，獲得兩個(gè)抗病基因功能片段[45]；2018年將編碼谷胱甘肽合成酶的StGCS-GS基因轉(zhuǎn)化到甜菜體內(nèi)，共獲得7個(gè)轉(zhuǎn)基因甜菜株系[46]。魯振強(qiáng)等將草甘膦靶基因At EPSPs的功能域進(jìn)行克隆獲得了抗草甘膦除草劑基因功能片段[47]；2018年采用同源克隆及cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法，首次從甜菜M14品系中克隆了與生殖相關(guān)的基因BvMARB的全長cDNA序列[48]。國內(nèi)關(guān)于甜菜叢根病的相關(guān)研究仍很有限。而國外Strausbaugh等研究了甜菜壞死黃脈病毒和冷凍溫度對(duì)甜菜根貯藏的影響。發(fā)現(xiàn)BNYVV不僅會(huì)導(dǎo)致感病甜菜品種的產(chǎn)量和蔗糖損失，而且當(dāng)溫度降至-2.2℃以下時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生更多的凍根組織。根據(jù)這些觀察，整個(gè)冬季用于非凍糖甜菜堆根冷卻的氣溫不應(yīng)低至-2.2°C以下，以最大限度地保持蔗糖[49]。

2.2 組學(xué)研究和m iRNA在甜菜叢根病上的研究進(jìn)展

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組的方法也大量應(yīng)用于甜菜研究中。Webb等研究了感病材料在病毒侵染后蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)哪些變化，通過脅迫處理后取葉片提取總蛋白，用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行定量分析。以闡明病毒與宿主植物互作過程中表達(dá)的蛋白類型。通過蛋白組學(xué)方法鑒定出203種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)功能蛋白主要是光合作用、能量代謝、新陳代謝以及與刺激反應(yīng)相關(guān)的蛋白。這些蛋白與一般植物防御反應(yīng)的系統(tǒng)獲得性抗性有關(guān)[50]。張輝等利用蛋白組學(xué)的方法研究了BNYVV侵染后不同材料的蛋白質(zhì)差異蛋白反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同材料對(duì)病毒脅迫處理產(chǎn)生的反應(yīng)有所不同，抗性材料表達(dá)的差異蛋白主要是光合作用蛋白、糖代謝蛋白、呼吸抗氧化作用蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及脂代謝等蛋白；感病材料表達(dá)的蛋白主要是光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白，即自身反應(yīng)表達(dá)的蛋白[51]。Fan等對(duì)BNYVV接種后的甜菜提取了總RNA，通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得重新組裝的基因序列數(shù)據(jù)75 917個(gè)SNP，平均長度為1 054 bp，通過BLAST比對(duì)，獲得39 372個(gè)SNP注釋。預(yù)測了4 834個(gè)簡單序列重復(fù)序列（SSRs），通過轉(zhuǎn)錄序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)261個(gè)基因在感染的植物中差異表達(dá)，128個(gè)基因上調(diào)，133個(gè)基因下調(diào)[52]。

植物微RNA（miRNAs）是一類在植物發(fā)育、防御和癥狀發(fā)展中起重要作用的非編碼RNA。近年來在不同作物上開展了大量的研究。Liu等利用測序的方法鑒定了547個(gè)miRNAs，其中包括129個(gè)miRNA家族，發(fā)現(xiàn)282個(gè)新miRNAs。差異表達(dá)分析后，對(duì)BNYVV感染相關(guān)的miRNAs進(jìn)行微陣列分析和RT-qPCR確證。發(fā)現(xiàn)38個(gè)miRNA家族包括103個(gè)已知miRNAs和45個(gè)新miRNAs。而這些具有表達(dá)差異的miRNAs參與激素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而可以促進(jìn)腋芽的發(fā)育和植物的防御[53]。

3 展望

甜菜叢根病能對(duì)甜菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害，導(dǎo)致甜菜根產(chǎn)量和含糖率的嚴(yán)重下降。目前，國外科研人員通過長時(shí)間的努力培育出了一些具有叢根病抗性資源的品種。國內(nèi)科研人員在叢根病抗性選擇上也付出了很大努力，通過長年的選育工作也取得了一定的成績，培育出了叢根病抗性品種。但對(duì)其育種材料的抗病機(jī)理并未研究清楚。因此著眼于國內(nèi)自育的抗性材料，期望從分子水平對(duì)其抗病機(jī)理展開一系列研究是我們未來的研究方向。利用現(xiàn)代分子技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)甜菜叢根病抗性品種的快速選育，以建立我國甜菜分子育種創(chuàng)新研究體系，對(duì)加快甜菜抗叢根病品種的培育工作有著重要的理論和實(shí)踐意義。