王在強(qiáng) 傅恩清

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白沉積為特征的肺間質(zhì)過度修復(fù)性疾病。微生物感染、粉塵接觸、藥物作用、射線照射、吸煙、遺傳等因素都可導(dǎo)致肺纖維化[1-2]。盡管導(dǎo)致肺纖維化的因素很多，但它們可能存在共同的致病機(jī)制。長期或反復(fù)的細(xì)胞損傷啟動了與免疫相關(guān)的損傷修復(fù)程序，造成異常激活的成纖維細(xì)胞不斷增殖[3-5]。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)是胸腺來源的CD4+T細(xì)胞亞群，持續(xù)性表達(dá)IL-2受體α鏈CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3[6]。雖然Treg細(xì)胞只占健康成人CD4+T細(xì)胞的5%～10%，但可以下調(diào)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，對維持免疫耐受十分重要[7]。人們對Treg細(xì)胞促進(jìn)還是抑制肺纖維化存在較大分歧。Treg細(xì)胞可能通過抑制成纖維細(xì)胞的增殖直接抑制纖維化,通過抗炎作用和降低輔助性T細(xì)胞的反應(yīng)間接抑制纖維化[8-9]。它也可能通過分泌促纖維化細(xì)胞因子如血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor-B, PDGF-B)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)促進(jìn)纖維化[7]。肺纖維化中Treg細(xì)胞的數(shù)量，有人認(rèn)為減少，有人認(rèn)為增多[10-15]。反映出人們對Treg細(xì)胞在肺纖維化中的作用了解還不夠深入。本文對Treg細(xì)胞在肺纖維化中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

一、肺纖維化中不同亞型的Treg細(xì)胞數(shù)量和功能發(fā)生變化

根據(jù)細(xì)胞表型和功能的差異，將Treg細(xì)胞分為三種亞型：CD45RA-CD25+++激活型Treg細(xì)胞、CD45RA+CD25++靜息型Treg細(xì)胞和CD45RA-CD25++分泌型Treg細(xì)胞[16]。激活型和靜息型Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，幾乎不分泌細(xì)胞因子。分泌型Treg細(xì)胞免疫抑制能力差，可大量分泌 IL-2、 IFN-γ和IL-17細(xì)胞因子。激活型Treg細(xì)胞絕大部分由靜息型Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，是主要發(fā)揮免疫抑制作用的Treg細(xì)胞。靜息型Treg細(xì)胞由胸腺生成，一旦靜息型Treg細(xì)胞被激活，就可以通過增強(qiáng)FoxP3表達(dá)轉(zhuǎn)化為激活型Treg細(xì)胞。

Hou等[17]對不同亞型的Treg細(xì)胞在特發(fā)性肺纖維化中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)肺纖維化組與健康對照組外周血中Treg細(xì)胞總數(shù)相同，但肺纖維化組中靜息型Treg細(xì)胞比例顯著下降，激活型Treg細(xì)胞比例升高，分泌型Treg細(xì)胞比例沒有變化。肺纖維化組支氣管肺泡灌洗液中激活型Treg細(xì)胞的數(shù)量和比例顯著增加。與外周血不同，分泌型Treg細(xì)胞在支氣管肺泡灌洗液的比例增加。核蛋白Ki-67是反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)[16]。肺纖維化組與健康對照組相比，靜息型Treg細(xì)胞表達(dá)Ki-67略微升高，而激活型Treg細(xì)胞表達(dá)Ki-67顯著升高，表明肺纖維化組激活型Treg細(xì)胞的增殖能力比健康對照組增強(qiáng)。肺纖維化中激活型Treg細(xì)胞增多是免疫穩(wěn)態(tài)被打破的標(biāo)志，并且外周血激活型Treg細(xì)胞的比例與肺纖維化嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[17]。

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, Tim-3)對Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能具有重要影響[18]。體外實(shí)驗(yàn)中，Tim-3+Treg細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于Tim-3-Treg細(xì)胞[19]。在急性肺損傷患者的外周血中，Treg細(xì)胞數(shù)量和Tim-3在Treg細(xì)胞中的表達(dá)都顯著提高[20]。Tim-3+Treg細(xì)胞能夠減少中性粒細(xì)胞的聚集并促進(jìn)其凋亡，降低膠原蛋白的表達(dá)和含量，從而抑制肺損傷后的肺部炎癥和纖維細(xì)胞增殖，但Tim-3-Treg細(xì)胞沒有這種功能[21]。

二、Treg細(xì)胞分泌促纖維化細(xì)胞因子可能不是肺纖維化中膠原蛋白沉積的主要原因

Lo等[7]發(fā)現(xiàn)敲除Treg細(xì)胞的肺纖維化小鼠與未敲除Treg細(xì)胞的肺纖維化小鼠相比，支氣管肺泡灌洗液中TGF-β和PDGF-B水平降低，但膠原蛋白含量相同。敲除Treg細(xì)胞的肺纖維化小鼠，可以通過CD4+效應(yīng)T細(xì)胞分泌IL-4等細(xì)胞因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。促進(jìn)作用與CD4+效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量呈正比，而且促進(jìn)纖維化的作用，只有在Treg細(xì)胞缺失時(shí)才能表現(xiàn)出來。Birjandi等[22]發(fā)現(xiàn)注射IL-2復(fù)合物的肺纖維化組與未注射IL-2復(fù)合物的肺纖維化組相比，肺組織中1型細(xì)胞因子IL-18含量顯著減少，Treg細(xì)胞數(shù)量、膠原蛋白和2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)顯著增加，但兩組間TGF-β和PDGF-B水平無差異。TGF-β和PDGF-B是Treg細(xì)胞重要的促纖維化細(xì)胞因子，在肺纖維化中Treg細(xì)胞數(shù)和膠原蛋白含量明顯上升的情況下，兩者均沒有升高。即使在Treg細(xì)胞被敲除了的情況下，肺纖維化中膠原蛋白含量依然沒有變化。以上兩點(diǎn)都提示Treg細(xì)胞分泌TGF-β和PDGF-B可能不是導(dǎo)致肺纖維化的主要途徑，提示還存在導(dǎo)致肺纖維化中膠原蛋白沉積的其他更重要的途徑。

三、Treg細(xì)胞表型發(fā)生改變，抑制功能喪失，促進(jìn)了肺纖維化

Treg細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性。Zhou等[23]認(rèn)為局部微環(huán)境以提供特定的細(xì)胞因子和/或細(xì)胞-細(xì)胞(或細(xì)胞-微生物)相互作用的方式，決定Foxp3+細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方向。Voo等[24]發(fā)現(xiàn)外周免疫系統(tǒng)的Treg細(xì)胞可以改變表型和功能。黏膜發(fā)炎時(shí)，外周血和淋巴組織中表達(dá)趨化因子受體6(chemokine receptors 6, CCR6)的Treg細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞并分泌IL-17。鮑文華等[25]發(fā)現(xiàn)大鼠肺纖維化組中Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且Th17細(xì)胞數(shù)與CCR6呈正相關(guān)，說明Th17細(xì)胞可能通過與CCR6相互作用參與肺纖維化發(fā)病過程。Foxp3持續(xù)表達(dá)是Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的基礎(chǔ)[26]。Zhou等[27]發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可以失去表達(dá)Foxp3、CTLA-4和CD25的能力，產(chǎn)生IL-2和IFN-γ等炎性細(xì)胞因子，喪失免疫抑制功能。Birjandi等[22]將Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)入Rag1-/-小鼠并用博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化，Treg細(xì)胞的數(shù)量顯著減少并且表型改變，CD25和Foxp3的表達(dá)顯著減少。Bian等[28]發(fā)現(xiàn)矽肺患者Treg細(xì)胞數(shù)量增多，但是表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞僅占CD4+CD25+T細(xì)胞的一小部分，其他Treg細(xì)胞表現(xiàn)出Th1和Th17細(xì)胞的表型，干擾素和IL-17表達(dá)升高而Foxp3和TGF-β表達(dá)降低，且Treg細(xì)胞抑制CD4+效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力顯著下降。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞關(guān)系密切，它們各自的特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和 RORγT都是TGFβ信號通路的下游靶點(diǎn)[29]。Raijmakers等[30]發(fā)現(xiàn)，正常Treg細(xì)胞與CD25+FoxP3+RORγT+IL-17A+促炎性Treg細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)化，Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)在兩者間的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。TLR2和CTLA-4表達(dá)減少促進(jìn)正常Treg細(xì)胞向促炎性Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化。正常Treg細(xì)胞可有效抑制Th17細(xì)胞，但當(dāng)正常Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促炎性Treg細(xì)胞時(shí)，就會喪失抑制作用。有研究表明，使用抗CTLA-4抗體的患者，結(jié)節(jié)樣肉芽腫性的發(fā)病率和嚴(yán)重程度都升高[31-32]，CTLA-4表達(dá)減少會降低Treg細(xì)胞對T細(xì)胞的調(diào)控能力[33]。還有研究表明，IL-17+ Treg仍具有抑制功能，只是在IL-1β和IL-6等炎性因子存在的情況下下才會喪失抑制能力[34]。在肺纖維化的微環(huán)境中，Treg細(xì)胞表型發(fā)生變化，免疫抑制功能即使沒有完全喪失，也有很大程度的下降。干擾素γ(interferon Type Ⅱ, IFN-γ)和 IL-4能夠抑制Foxp3在Treg細(xì)胞中的表達(dá)，而CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhance-binding protein, C/EBP)可以解除這種抑制作用，促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成并增強(qiáng)其免疫抑制功能[35]。因此，C/EBP可能在維持Treg細(xì)胞正常表型中發(fā)揮了重要作用。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, AdSCs)能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，抑制 Th2型CD4+T細(xì)胞分化增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化增殖，改變T淋巴細(xì)胞的亞型可能是脂肪干細(xì)胞抑制肺纖維化中炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一[36]。CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞在某些調(diào)節(jié)下也可以轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細(xì)胞[37-39]。產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(IL-10-producing regulatory B cell, B10) 可以增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能，促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞[40-42]。減少B10數(shù)量可以抑制Foxp3的表達(dá)，導(dǎo)致Foxp3+ Treg的數(shù)量降低，減輕肺纖維化[43]。

四、提高肺纖維化中Treg細(xì)胞的數(shù)量可能會加重肺纖維化

Birjandi等[22]通過IL-2復(fù)合物擴(kuò)增肺纖維化中的Treg細(xì)胞，加重了肺纖維化。咪唑硫嘌呤可以提高Treg細(xì)胞數(shù)量，但硫唑嘌呤治療特發(fā)性肺纖維化的多中心臨床試驗(yàn)顯示，使用硫唑嘌呤后，肺纖維化患者的住院次數(shù)和病死率增加[44-45]。在Treg細(xì)胞數(shù)量增加促進(jìn)肺纖維化方面，兩者觀點(diǎn)相一致。

在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中，Birjandi等[22]認(rèn)為是博來霉素直接誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞表型的改變。Raijmakers等[30]發(fā)現(xiàn)曲霉菌本身不能抑制CTLA-4的表達(dá)，認(rèn)為是曲霉菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了正常Treg細(xì)胞向促炎性Treg轉(zhuǎn)化所需要的炎癥介質(zhì)。我們認(rèn)為不是博來霉素直接誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞表型的改變，而是博來霉素導(dǎo)致肺損傷后，機(jī)體產(chǎn)生了能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表型變化的微環(huán)境。在該微環(huán)境下，Treg細(xì)胞表型改變，轉(zhuǎn)化為促炎性Treg，抑制功能喪失，失去了對CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用，造成CD4+效應(yīng)T細(xì)胞大量增殖，進(jìn)而成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白沉積，促進(jìn)了肺纖維化。這符合不同損傷因素都能導(dǎo)致肺纖維化的事實(shí)。因此，在不改變肺內(nèi)微環(huán)境的情況下，即使增加Treg細(xì)胞的數(shù)目，Treg細(xì)胞也可能會在微環(huán)境下改變表型，喪失功能，不能對CD4+效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，而且會轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔訲細(xì)胞，加重肺纖維化。 Zhou等[23]也認(rèn)為，當(dāng)肺纖維化微環(huán)境已經(jīng)建立的情況下，Treg細(xì)胞治療肺纖維化可能無效甚至有害，因?yàn)門reg細(xì)胞會在此微環(huán)境下改變表型和功能。在博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化后的第14天，過繼轉(zhuǎn)移Treg細(xì)胞可以顯著減輕肺纖維化，但研究者沒有對肺纖維化晚期過繼轉(zhuǎn)移Treg的效果進(jìn)行研究[46]。研究發(fā)現(xiàn)在矽肺模型中，于造模第4周經(jīng)鼠尾靜脈輸入間充質(zhì)干細(xì)胞，肺纖維化程度比對照組降低[47]。Liu等[48]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療放射性肺損傷時(shí)，在急性期(照射后6 h)使用要比在后期(照射后28 d)使用減輕炎癥和抑制纖維化的效果更好。因此，在肺損傷(injuvy of lungs)后肺微環(huán)境改變前進(jìn)行干預(yù)，對抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展十分重要，一旦導(dǎo)致肺纖維化的微環(huán)境形成，肺纖維化過程將很難糾正。研究表明，通過抗CD25單抗在肺纖維化早期去除Treg細(xì)胞減輕纖維化，而在肺纖維化晚期去除Treg細(xì)胞則加重纖維化，因此認(rèn)為Treg細(xì)胞在小鼠肺纖維化的早期起促進(jìn)纖維化作用，但在肺纖維化的晚期起抑制纖維化作用[49]。我們不認(rèn)為是一種細(xì)胞在疾病不同階段發(fā)揮了相反的作用，可能性更大的是在肺纖維化晚期，使用抗CD25單抗去除了殘存的還能夠正常發(fā)揮抑制功能的Treg細(xì)胞，因此會加重肺纖維化。在肺纖維化早期，抗CD25單抗抑制了Treg細(xì)胞的生成，減少了后期轉(zhuǎn)化為促炎性Treg細(xì)胞的數(shù)量，因此減輕了肺纖維化。

綜上所述， 肺纖維化中不同亞型的Treg細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，而且這種變化與肺纖維化嚴(yán)重程度有相關(guān)性。因此，可以將不同亞型Treg細(xì)胞數(shù)量作為判斷肺纖維化患者預(yù)后的指標(biāo)，把恢復(fù)Treg細(xì)胞亞型間的平衡作為治療肺纖維化的備選方案[17]。不同亞型的Treg細(xì)胞都表達(dá)CD25，因此CD25不適合作為篩選不同亞型Treg細(xì)胞的標(biāo)志分子，要進(jìn)一步尋找不同亞型Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志分子，以便對不同亞型Treg細(xì)胞進(jìn)行分類研究。Treg細(xì)胞表型在肺纖維化中發(fā)生變化，由具有免疫抑制作用的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔约?xì)胞，解釋了肺纖維化中Treg細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子同時(shí)增多的現(xiàn)象，阻斷Treg細(xì)胞表型改變和恢復(fù)Treg細(xì)胞的表型可能成為預(yù)防和治療肺纖維化的新方案。當(dāng)前，對肺纖維化中不同亞型Treg細(xì)胞數(shù)量和功能改變的機(jī)制還不了解。在肺纖維化微環(huán)境中，促炎性Treg細(xì)胞是Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變的終末細(xì)胞，還是會進(jìn)一步向Th2和/或Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化仍不明確。尤為重要的是，肺損傷后微環(huán)境誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表型改變的機(jī)制尚不清楚，Treg細(xì)胞表型和功能改變究盡是肺纖維化的始動因素還是存在上游的調(diào)控作用，已成為當(dāng)前亟待解答的問題。