杜沅原， 井昶雯， 吳建中， 馬蓉， 馮繼鋒

最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球男性和女性中第三大常被診斷出的癌癥，也是男性癌癥死亡的第二大原因[1]。盡管50歲及以上成年人死亡率下降，但自2000年以來，年輕人的發(fā)病率和死亡率繼續(xù)上升[2]。白藜蘆醇(3，5，4-三羥基二苯乙烯)是一種天然存在的多酚化合物，存在于許多植物中，包括葡萄(特別是葡萄皮)，藍(lán)莓，花生和紅葡萄酒等食品中。白藜蘆醇具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗氧化，抗炎，抗癌，心臟保護(hù)，神經(jīng)保護(hù)和抗糖尿病活動(dòng)[3]。本文總結(jié)近年來白藜蘆醇作用于結(jié)直腸癌的機(jī)制的研究進(jìn)展，為白藜蘆醇預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 白藜蘆醇對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡增殖的影響

1.1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的阻滯誘導(dǎo)凋亡 Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在HCT116和Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞中，白藜蘆醇可以通過caspase/cyclin-CDK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S停滯，白藜蘆醇處理細(xì)胞后，觀察到CDK2， CDK4， cyclin D1水平的升高，以及cleaved-caspase-7、cleaved-caspase-9 和 cleaved-poly(ADP-ribose) 聚合酶表達(dá)的升高[4]。后續(xù)研究進(jìn)一步證明，白藜蘆醇抑制細(xì)胞增殖，并以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期進(jìn)入G0/G1期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。

1.2 通過相關(guān)分子信號通路誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖 大量研究表明，白藜蘆醇通過多種信號通路誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇可以通過分別調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT和Wnt/β-catenin傳導(dǎo)來介導(dǎo)在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗增殖作用。白藜蘆醇可以上調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)的表達(dá)并降低AKT1/2的磷酸化，而PTEN的外源性表達(dá)抑制PI3K/AKT信號并促進(jìn)白藜蘆醇在HCT116細(xì)胞中的抗增殖作用，而且白藜蘆醇降低了β-catenin的蛋白和mRNA表達(dá)[6-7]。白藜蘆醇還可降低結(jié)直腸癌中TCF4的表達(dá)，減少外源引入的TCF4蛋白的細(xì)胞積累，但不改變TCF4轉(zhuǎn)錄。在暴露于白藜蘆醇的細(xì)胞中，TCF4半衰期降低。通過ERK和p38依賴性途徑增加絲氨酸/蘇氨酸殘基的TCF4磷酸化，同時(shí)TCF4敲低降低了TCF/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性并增強(qiáng)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。另外，白藜蘆醇通過上調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞中的BMP7來滅活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)失活，可上調(diào)BMP9表達(dá)激活p38MAPK，誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞的凋亡[9-10]。另1項(xiàng)在SW620腸癌細(xì)胞中的研究表明，白藜蘆醇以劑量依賴性促進(jìn)BAX，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，降低抗凋亡分子Bcl2的表達(dá)，同時(shí)顯著降低MEK/ERK信號通路中Ras，Raf，MEK和ERK1/2的表達(dá)[11]。

Reddivari等[12]通過將白藜蘆醇和葡萄籽提取物的組合，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過升高的P53阻斷 PARP和改變BAX/Bcl-2比率，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡[12]。還有研究表明，白藜蘆醇下調(diào)了JAK-STAT途徑，降低了細(xì)胞核中活化的STAT1的水平，并且，白藜蘆醇降低了細(xì)胞因子刺激的SAPK/JNK通路激活[13]。

Buhrmann等[14]首次證明白藜蘆醇調(diào)節(jié)TNF-β信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB活化，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，CSCs形成和并增加細(xì)胞對氟尿嘧啶的敏感性[14]。并且白藜蘆醇在結(jié)直腸癌細(xì)胞通過HDAC3/p300介導(dǎo)的NF-κB信號通路上調(diào)PD-L1表達(dá)[15]。

Du等[16]研究表明，白藜蘆醇明顯抑制HCT116細(xì)胞活力和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Ptch，Smo和Gli-1蛋白表達(dá)降低，表明這種抑制作用通過hedgehog/gli-1信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)[16]。

1.3 通過相關(guān)Micro-RNA抑制結(jié)直腸癌的增殖 Saud等[17]在利用基因敲除和K-ras過表達(dá)的結(jié)直腸癌小鼠模型中，研究白藜蘆醇給藥(105 mg和210 mg)的效果，腫瘤產(chǎn)生和腫瘤大小的抑制率為60%。由此得出結(jié)論，白藜蘆醇可增強(qiáng)miR-96表達(dá)，并通過下調(diào)K-ras表達(dá)來預(yù)防結(jié)直腸腫瘤的形成和生長[17]。Tsunoda等[18-19]在通過構(gòu)建HCT116人細(xì)胞的三維結(jié)腸隱窩模型發(fā)現(xiàn)，致癌基因K-ras可以上調(diào)磷酸二酯酶4表達(dá)，白藜蘆醇可通過抑制磷酸二酯酶4的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞空腔性凋亡。

白藜蘆醇通過上調(diào)miR-34c而進(jìn)一步降低其靶KITLG抑制腸癌細(xì)胞增殖，此外，Res以miR-34c依賴性方式與奧沙利鉑發(fā)揮協(xié)同作用[20]。還可通過上調(diào)HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖[21]。

1.4 通過DNA損傷途徑抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖 Demoulin等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇誘導(dǎo)的小鼠腸癌細(xì)胞凋亡通過激活P53以及共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變(ATM)激酶而產(chǎn)生，并伴隨由Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶中毒導(dǎo)致的DNA損傷。在HCT-116細(xì)胞中，用25 μM濃度的白藜蘆醇處理后，觀察到PARP-1的裂解和染色質(zhì)濃縮。

Colin等[23]觀察到體外和體內(nèi)結(jié)腸癌模型可以逐漸逃脫白藜蘆醇的重復(fù)刺激，與親本細(xì)胞相比出現(xiàn)了更高程度的倍性和大核化。這種反應(yīng)與對DDR細(xì)胞凋亡和衰老的瞬時(shí)激活相關(guān)。作者進(jìn)一步證明這種DNA損傷是由于活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生引起的，癌細(xì)胞在長期接觸RSV后可以適應(yīng)這種活性氧。低濃度的白藜蘆醇對誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡沒有顯著影響，但延遲了S期循環(huán)。這些瞬時(shí)效應(yīng)和抗性的出現(xiàn)與細(xì)胞逐漸逃避白藜蘆醇誘導(dǎo)的DNA損傷能力有關(guān)[23]。后續(xù)研究表明，在較低濃度(1 μmol/L和10 μmol/L)下，白藜蘆醇增加了HT-29結(jié)腸直腸腺癌數(shù)量，白藜蘆醇誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞毒性與NADPH氧化酶活化和組蛋白γH2AX水平升高有關(guān)，組胺γH2AX是DNA損傷的標(biāo)志[24]。

據(jù)Schroeter等[25]報(bào)道，白藜蘆醇(≥100 μM和250 μM)抵消了DOX誘導(dǎo)的TOP-Ⅱα和TOP-Ⅱβ的DNA-TOP-中間體的形成。它還通過調(diào)節(jié)保護(hù)作用和減少DOX的細(xì)胞內(nèi)濃度來調(diào)節(jié)DOX的DNA鏈斷裂潛力[25]。

1.5 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的其他機(jī)制 白藜蘆醇可以與細(xì)胞表面整合素αvβ3上的特定位點(diǎn)結(jié)合，通過抑制COX-2表達(dá)引發(fā)腸癌細(xì)胞凋亡。然而，白藜蘆醇激活結(jié)腸癌細(xì)胞中的RRM2基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，從而導(dǎo)致白藜蘆醇誘導(dǎo)的COX-2核積累受到抑制，進(jìn)而抑制了白藜蘆醇的抗癌作用[26-27]。

Tristetraprolin(TTP)是一種富含AU的元件結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性并降低人類癌癥的表達(dá)，白藜蘆醇通過負(fù)調(diào)節(jié)cIAP2，E2F1，LATS2和Lin28表達(dá)來增強(qiáng)TTP在HCT116和SNU81細(xì)胞中的抑制活性[28]。

白藜蘆醇還可阻斷活化的巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)[29]，當(dāng)用Caco-2培養(yǎng)基或直接用白藜蘆醇和奧沙利鉑的組合共同處理巨噬細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)了促炎癥反應(yīng)的M-1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[30]。

Yang等[5]研究也說明了白藜蘆醇可以上調(diào)結(jié)直腸癌干細(xì)胞中主要組織相容性復(fù)合物I類相關(guān)鏈A和B(MICA/B)的表達(dá)，增強(qiáng)腸癌細(xì)胞免疫原性[5]。

2 促進(jìn)自噬

在一項(xiàng)關(guān)于白藜蘆醇及其代謝物白藜蘆醇-硫酸鹽對HT-29和HCA-7細(xì)胞的影響中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇-硫酸鹽處理的細(xì)胞顯示存在自噬體，晚期自噬區(qū)室和自噬溶酶體。進(jìn)一步的分析表明，白藜蘆醇-硫酸鹽顯著增加可溶性微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3-I)向脂質(zhì)結(jié)合的LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，然后將其募集到吞噬細(xì)胞膜并導(dǎo)致自噬的開始，然而在正常HCEC細(xì)胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象。白藜蘆醇硫酸鹽還引起CDKN1A/P21的顯著上調(diào)和HT-29細(xì)胞中SA-β-gal染色的增加，但在正常HCEC細(xì)胞中沒有，這表明癌細(xì)胞正在衰老。值得注意的是，當(dāng)HT-29細(xì)胞與白藜蘆醇-硫酸鹽和強(qiáng)效類固醇硫酸酯酶抑制劑雌酮3-O-氨基磺酸鹽(EMATE)共溫育時(shí)，兩種作用都會(huì)減弱。相對于單獨(dú)的白藜蘆醇-硫酸鹽處理，EMATE顯著降低了白藜蘆醇的細(xì)胞內(nèi)濃度和LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。隨著EMATE的加入，CDKN1A的表達(dá)也降低，表明白藜蘆醇本身而非硫酸鹽代謝物在這些結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬和衰老[31]。

3 抑制結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移

白藜蘆醇可以通過TGF-β1/Smads信號通路介導(dǎo)的Snail/E-鈣黏蛋白表達(dá)抑制結(jié)腸直腸癌中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Buhrmann等[32]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制LoVo細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。 在小鼠原位移植中，白藜蘆醇降低了肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。抑制LoVo細(xì)胞的侵襲和遷移能力，增加E-cadherin的表達(dá)，抑制Vimentin的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads信號通路。 同時(shí)，白藜蘆醇在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT啟動(dòng)期間降低了EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail的水平和E-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄[32]。

另一項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇通過靶向Sirt1抑制腫瘤發(fā)生，可以下調(diào)NF-κB的核定位，降低NF-κB的磷酸化及其乙?；?，導(dǎo)致NF-κB調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物(MMP-9，CXCR4)的減少，MMP-9和CXCR4參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。通過Sirt1上調(diào)，抑制粘著斑激酶(FAK)及粘著斑活性，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡[33-34]。

4 影響結(jié)直腸癌的代謝

白藜蘆醇的抗癌機(jī)制可能存在于靶向控制癌細(xì)胞代謝，促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈超載，并最終增加ROS產(chǎn)生。RSV的細(xì)胞毒性作用與線粒體生物合成和脂肪酸氧化增加所引起的氧消耗增加有關(guān)。這種Warburg效應(yīng)的部分逆轉(zhuǎn)之后是線粒體膜的超極化和ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[35]。

Saunier等[36]研究證明，白藜蘆醇(10 μM，48 h)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中的細(xì)胞生長停滯和代謝重編程。白藜蘆醇改變脂質(zhì)組學(xué)特征，增加氧化能力并減少糖酵解，與磷酸戊糖活性降低和ATP產(chǎn)生增加有關(guān)。白藜蘆醇靶向丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合物，導(dǎo)致PDH活性增強(qiáng)，PHD是線粒體能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)。通過CamKKB或下游AMPK途徑的抑制部分地消除了白藜蘆醇誘導(dǎo)的葡萄糖氧化的增加，表明白藜蘆醇可能通過CamKKB/AMPK途徑改善癌細(xì)胞的氧化能力[36]。

另一項(xiàng)在結(jié)腸癌Apc Min/+小鼠模型中研究表明，白藜蘆醇通過削弱生物轉(zhuǎn)化途徑和DNA加合物形成來減輕BaP誘導(dǎo)的結(jié)腸癌發(fā)生[37]。

5 與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用

5.1 與奧沙利鉑的聯(lián)合應(yīng)用 白藜蘆醇誘導(dǎo)了奧沙利鉑處理的HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的恢復(fù)，Bcl-2/caspase-3表達(dá)的恢復(fù)[38]。白藜蘆醇抑制HT-29和HCT-116 CRC細(xì)胞的細(xì)胞活力，增殖，遷移和侵襲以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇通過在體外和體內(nèi)特異性激活miR-34c-KITLG來抑制結(jié)直腸癌。此外，白藜蘆醇以miR-34c依賴性方式與奧沙利鉑發(fā)揮協(xié)同作用[20]。Wang等[39]通過處理對奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116/L-OHP)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以下調(diào)P-糖蛋白/多藥耐藥蛋白1(P-gp/MDR1)的表達(dá)水平，降低MDR1啟動(dòng)子活性。并且通過增強(qiáng)奧沙利鉑的細(xì)胞內(nèi)積累，可以減少藥物外排和下調(diào)MDR1表達(dá)來逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性。白藜蘆醇能降低IκBα的磷酸化水平和抑制NF-κB活性，并降低NF-κB亞基p65的核轉(zhuǎn)位。此外，啟動(dòng)子活性和MDR1表達(dá)的下調(diào)由白藜蘆醇誘導(dǎo)的AMP活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化介導(dǎo)，并且可以抑制cAMP反應(yīng)性元件轉(zhuǎn)錄活性，這些結(jié)果表明，白藜蘆醇對HCT116/L-OHP細(xì)胞中MDR1表達(dá)的抑制作用與以AMPK依賴性方式抑制NF-κB信號傳導(dǎo)和CREB活化密切相關(guān)[39]。白藜蘆醇與奧沙利鉑的共同給藥可減輕奧沙利鉑引起的小鼠的腸神經(jīng)毒性和胃腸功能障礙[40]。

5.2 與5-氟尿嘧啶的聯(lián)合應(yīng)用 Buhrmann等[41]研究證明，白藜蘆醇阻斷了正常結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480，HCT116)及5-氟尿嘧啶耐藥的細(xì)胞系(SW480R，HCT116R)的生長，并與5-氟尿嘧啶協(xié)同抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。白藜蘆醇上調(diào)HCT116R和HCT116細(xì)胞中間隙和緊密連接，橋粒和粘附分子的表達(dá)。 此外，通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)因子(增加的E-鈣黏蛋白，減少的波形蛋白和slug)和下調(diào)NF-κB活化及其向細(xì)胞核的易位和消除NF-κB調(diào)節(jié)來減弱耐藥性[41]。Li等[42]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和5-氟尿嘧啶組合，通過抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的STAT3和AKT信號傳導(dǎo)途徑來增強(qiáng)抗端粒酶活性和細(xì)胞凋亡。通過下調(diào)炎癥生物標(biāo)志物pSTAT3和pNFκB顯示出抗炎作用。用白藜蘆醇和5-氟尿嘧啶可抑制STAT3磷酸化及其與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。說明增強(qiáng)結(jié)直腸癌中5-FU的抗端粒和促凋亡，可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的耐藥[42]。

5.3 與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用 Osman等[43]研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇(15 μg/ml)增加了順鉑對順鉑耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，同時(shí)導(dǎo)致早期凋亡部分顯著增加并增強(qiáng)順鉑的后續(xù)凋亡效應(yīng)。與單獨(dú)的順鉑治療相比，在白藜蘆醇存在下細(xì)胞對順鉑的攝取顯著增加，并且白藜蘆醇使順鉑耐藥的HCT-116細(xì)胞敏感[43]。

5.4 與多柔比星的聯(lián)合應(yīng)用 白藜蘆醇通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)多柔比星的包埋而增加結(jié)腸直腸癌細(xì)胞對多柔比星的敏感[44]。

6 結(jié)論

綜上所述白藜蘆醇能夠：①誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖；②誘導(dǎo)自噬；③抑制結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移；④影響癌細(xì)胞代謝；⑤增強(qiáng)化療效果，逆轉(zhuǎn)耐藥。在許多研究中，發(fā)現(xiàn)RSV增強(qiáng)癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。 然而，由于其口服生物利用度有限，作為人類治療劑的效用仍需進(jìn)一步研究。目前還需開發(fā)與研究新的衍生物和新型治療劑，以增強(qiáng)其預(yù)防和治療作用。