邊片 巴羅 次仁德吉 米瑪 楊芳麗 巴頓

(1.西藏日喀則市人民醫(yī)院綜合內科,西藏 日喀則 857000；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，西藏 拉薩 850000)

慢性鼻竇炎嚴重影響人類健康生活，其發(fā)病率呈不斷增長趨勢，在西方國家發(fā)病率高達20%以上[1]。我國各地方慢性鼻竇炎的患病率和發(fā)病率都較高并有逐年增加趨勢，但目前尚無權威性流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)。目前慢性鼻竇炎伴息肉(CRSwNP)研究較為廣泛且存在區(qū)域及種族間顯著差異；最典型特征免疫效應性T細胞上目前慢性鼻竇炎中已知的有Th1/Th2/Th17等細胞，在歐美人群中慢性鼻竇炎中慢性鼻竇炎不伴息肉 (CRSsNP)中以Th1/Th17占優(yōu)勢，而CRSwNP中以表現(xiàn)Th2占優(yōu)勢并且與哮喘發(fā)病存在顯著相關[2-3]。相反在相似臨床特征的亞洲人種鼻息肉中相對缺乏嗜酸性粒細胞浸潤及相關因子的表達，主要以中性粒細胞浸潤并相關因子表達為主，并且以Th1/Th17極化特征；其哮喘發(fā)病率較低且與金葡菌超抗原無顯著相關性[4-5]。近年來國內不同地區(qū)慢性鼻竇炎研究發(fā)現(xiàn)其免疫表型及機制尚存在較大差異，表明慢性鼻竇炎異質性很強[6-8]。西藏高原地區(qū)門診病人中慢性鼻竇炎居耳鼻咽喉科疾病譜首位，藏族人群大部分居住于平均海拔4000米以上的寒冷空氣稀薄地帶、日照長濕度低等環(huán)境相對惡劣，加之醫(yī)療條件相對較落后及診療觀念較為傳統(tǒng)[9]。造成人群中慢性鼻竇炎從病因、發(fā)病機制特點上與其它地方可能存在較大地域差異，為此我們對該人群中CRS進行深入研究，以有助于發(fā)現(xiàn)更有效的治療靶點。

1 對象和方法

1.1 對象選擇 分別收集2016年3月～2017年10月在日喀則市人民醫(yī)院和西藏自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科就診的105例患者(女性46名，男性59名)，年齡16～60歲；其中慢性鼻竇炎35例(CRSsNP 35例)，慢性鼻竇性伴鼻息肉40例(CRSwNP 40例)，鼻中隔偏曲30例(對照組)。術前所有患者停用各種劑型類固醇激素和抗生素至少3周以上。排除和納入標準按EP3OS指南[1]。標本收集；CRSwNP患者樣本取自息肉組織，CRSsNP患者鉤突及篩竇黏膜，對照組織樣本取自中隔偏曲行鼻中隔成型術患者的部分中鼻甲粘膜組織。將組織樣本于術中采集后迅速置于液氮中冷凍并轉送實驗中心儲存于-80°C 冰箱標本庫免疫檢測備用，另將較小塊用于免疫組化分析的組織于4%福爾馬林固定并繼石蠟包裹。對所有篩選進入研究的受試者均術前對癥狀進行VAS分級評分及咽式子鼻腔分泌物送微生物細菌培養(yǎng)等。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫熒光檢測炎癥因子 將105例標本先行稱重，每0.1g 標本加入1.0ml 0.9%NaCl溶液，勻漿前加入混合蛋白酶抑制劑(Complete Roche; Mannheim, Germany)。組織勻漿(Braun 勻漿器1500rpm轉速5分鐘)。勻漿液在4°C下離心(3000rpm轉速，15分鐘),收集上清液分裝EP管-80°保存待免疫物質檢測分析。采用Luminex 100分析儀(Luminex 100 System, Ausin, Tesas USA)，試劑盒為Fluorokine MAP Multiplex Kits (R&D Systems, Minneapolis,MN,USA)，測定 IL-1β、IL-2sRα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17和 IFN-γ等, 使用Unicap100分析儀檢測ECP、MPO 和總IgE水平，操作步驟嚴格依從試劑盒說明。

1.2.2 免疫組化 主要用于評估B細胞(CD20)、單核巨噬細胞系統(tǒng)(CD68)、漿細胞(CD138)、肥大細胞(肥大細胞類胰蛋白酶)、T細胞(CD4)及中性粒細胞(MPO)等。石蠟切片37℃風干24小時，常規(guī)脫蠟至水；蒸餾水洗3次；進一步分別與1%濃度的鼠坑人單克隆抗體；CD20 (clone L26; Dako)、CD68 (clone EBM11;Dako)、CD138 (clone MI15; Dako)、MPO (clone 2C7; Serotec, Oxford, UK)、肥大細胞類胰蛋白酶(clone AA1;Dako)以及1%人抗CD4抗體(AF-379-NA, R&D)在30°C下培養(yǎng)45分鐘后用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水沖洗10分鐘，并且進一步與EnVision (DaKo Cytomation, California, USA)。再次在30°C下培養(yǎng)45分鐘，所有操作使用免疫組化全自動染色機(Autostainer，DaKo,USA)完成，最終蘇木精復染。染色后的切片被酸化水用兩步法沖洗，然后用100%的乙醇通過三步法脫水并且用Permount TM 爬片設備(Bioss, Beijing, China)爬片，中性樹膠封固。

1.2.3 微生物鑒定 術前無菌操作下利用咽式子于雙側鼻腔中鼻道取出分泌物送微生物細菌培養(yǎng)，按照嚴格無菌原則將分泌物分別在羊血瓊脂 (DiMed, St.Paul,Minn USA), 伊紅美藍瓊脂(Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville,Md. USA) 和巧克力瓊脂(BioMerieux, Marcy l'Etoile, France)等培養(yǎng)基上培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基根據(jù)菌種需要在25-37℃室溫及有氧或無氧條件下培養(yǎng)，根據(jù)細菌學方法分別在24小時，48小時及72小時不同時間段上觀察細菌生長情況，若超過72小時無細菌生長視為無培養(yǎng)菌。培養(yǎng)滿3天后通過濁度分析法將明確生長或懷疑生長的菌落分別置于3種不同Vitek系統(tǒng)細菌菌譜鑒定卡(bioMérieux, 中國上海)，主要由；GP卡辨認所有革蘭氏陽性球菌，GN卡辨認所有革蘭氏陰性桿菌和YST卡辨認芽孢真菌類等，按照使用說明培養(yǎng)鑒定[7]。光學掃描器根據(jù)測量光線強弱來決定細菌菌種。數(shù)據(jù)資料將ID 32E 系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)資料應用統(tǒng)計分析軟件包SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析。定量資料采用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗Kruskal-Wallis和Mann-Whitney 雙尾U檢驗)，檢驗水準α=0.05；基線變化分析采用方差分析或Fisher確切概率法及卡方檢驗等。

2 結果

2.1 三組一般資料及臨床特點比較 根據(jù)EPOS指南對納入的各組進行臨床癥狀評分，兩組鼻竇炎與對照組相比有較顯著差異。主要表現(xiàn)在；總癥狀評分明顯偏高，以鼻阻，流涕，頭疼及失嗅為主要癥狀。其中鼻息肉中以鼻阻、失嗅、鼻癢癥狀和哮喘發(fā)病率有顯著升高，而單純鼻竇炎中以頭痛及流涕較為明顯。影像學上鼻息肉積分最高鼻竇炎為其次各組間有統(tǒng)計學差異。見表1。

表1 三組一般資料及臨床癥狀比較 Table 1 Patient characteristics and symptom scores

2.2 藏族人群不同臨床表型慢性鼻竇炎中免疫細胞因子指標比較 CRSsNP中IFN-γ、IL-17及L-8, IL-2sRa、IL-1β及MPO表達水平顯著高于對照組(P<0.05),其中部分指標比CRSwNP中呈增高趨勢。CRSwNP患者息肉組織中IL-5、ECP、IL-6及總IgE水平顯著高于CRSsNP和對照組。見表2。

2.3 CRS中各種炎癥細胞計數(shù)比較 各標記物免疫組化在兩組鼻竇炎均有不同程度的表達，其中CD4、CD20及CD138細胞計數(shù)兩組鼻竇炎中的表達均高于對照組(P<0.05)，而兩組鼻竇炎間無顯著差異。Trytase(肥大細胞)和HE(嗜酸性細胞)細胞計數(shù)在鼻息肉組中顯著高于其他兩組(P<0.05)；而MPO及CD68表達陽性細胞計數(shù)在單純鼻竇炎中顯著高于其他組(P<0.05)，見表3。

表2 三組中主要炎癥介質表達差異的比較Table 2 The concentrations of inflammatory mediators

注：數(shù)據(jù)由中位數(shù)和可信區(qū)間表達，P值由非參數(shù)U檢驗。P≤0.05為有統(tǒng)計學意義 ( NS;沒有顯著性差異. ;對照vs 鼻竇炎.;對照vs 鼻息肉. §;鼻竇炎 vs 鼻息肉)

表3 免疫組化表達陽性細胞數(shù)比較Table 3 IHC staining positive cells count

注：標記物代表細胞：CD4(T細胞)， CD20(淋巴細胞)， CD138(漿細胞)，Trytase(肥大細胞)，MPO(中性粒細胞)，CD68 (單核巨噬細胞)，HE(嗜酸性粒細胞)。標注：NS;無顯著差異 ;對照vs鼻竇炎;對照vs 鼻息肉. §;鼻竇炎 vs 鼻息肉

2.4 不同鼻竇炎及對照中鼻腔微生物培養(yǎng)結果 在伴有鼻息肉鼻竇炎中革蘭氏陽性菌培養(yǎng)率增高且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，其中金黃色葡萄球菌與其它組有明顯差異(均P≤0.05);反之在不伴有息肉鼻竇炎中革蘭氏陽性菌培養(yǎng)較為明顯但差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 不同鼻竇炎及對照中鼻腔微生物分類比較[n(×10-2)]Table 4 Microbial species isolated from the nasal passages of control and CRS

3 討論

目前由于對慢性鼻竇炎炎癥免疫機制的復雜性及調控因素全面深入認識的缺乏，造成不同種族、區(qū)域表現(xiàn)不同免疫表型及炎癥模式特征的報道[10-11]。為此，根據(jù)現(xiàn)在尚存免疫表型機制多樣性特點將CRS表型進行深入廣泛研究勢在必行[12]，只有表型機制的深入研究可能解決慢性鼻竇炎治療上比較單一干預手段及突破開展基礎研究的瓶頸[13]。盡管絕大多數(shù)白種人群慢性鼻竇炎中CRSwNP顯示Th2免疫表型嗜酸性炎癥模式特征[2,5]；亞洲人群CRSwNP中主要以Th1或Th17傾向中性粒細胞炎癥特征，并且哮喘發(fā)病率明顯低于西方人群[4，6-7]。但不論種族、區(qū)域不同大部分其CRSsNP均表現(xiàn)為Th1免疫表型中性粒細胞炎癥趨勢之特征。高原藏族人群大部分常年居住高寒空氣稀薄惡劣環(huán)境地帶，加之醫(yī)療條件較落后及診療觀念較為傳統(tǒng)。由于地域限制造成的潛在隔離性決定了慢性鼻竇炎病因學上與其它地域可能存在較大差異， 由此可能導致免疫機制上存在特殊的一面[9]。為此我們開展藏族人群慢性鼻竇炎臨床特征及基礎免疫微生物研究發(fā)現(xiàn)；其中CRSwNP比CRSsNP具有更強炎癥浸潤現(xiàn)象，進一步免疫指標檢測提示CRSwNP中Th2相關因子IL-5、ECP和IgE升高，同時還伴隨IL-6顯著升高。組織學上以浸潤嗜酸性粒細胞和肥大細胞更為顯著；而在 CRSsNP中具有Th1相關因子IFN-γ與Th17相關IL-17升高趨勢，組織學有較強MPO+(中性粒細胞)和CD68+ (巨噬細胞)浸潤表達。同樣兩組CRS中均有較強CD4+(T淋巴細胞), CD138+(漿細胞)和CD20+(B淋巴細胞)等各種炎癥細胞浸潤表達，表明二者均有較強炎性反應特征。從兩組鼻竇炎免疫炎癥特征能夠初步反應其炎癥趨勢性特征，即反映伴有息肉的鼻竇炎多類似于變態(tài)反應改變?yōu)檎純?yōu)勢；而不伴鼻息肉鼻竇炎表現(xiàn)出鼻鼻竇黏膜局部細菌感染導致。另外CD68+特異性巨噬細胞浸潤與TGF-b1增高組織重塑更能說明單純鼻竇炎中細菌感染所發(fā)生的免疫連鎖反應，也符合國內外眾多文獻報道[14-15]。另外，上述結果中CRSsNP免疫炎癥特征與眾多亞洲及西方人群CRS免疫炎癥趨勢相符合[16]，而CRSwNP免疫反應呈現(xiàn)出Th2傾向嗜酸性炎癥反應特征類似白種人免疫反應趨勢，偏離亞洲人群鼻息肉免疫表性特征。而在泰國人群鼻息肉中同樣Th17傾向中性粒細胞炎癥模式型居多，但發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移其向Th2傾向嗜酸性炎癥模式的轉化趨勢[17]，而我們的結果首先不排除樣本偏小及實驗誤差所致的偏差，再者理論上也存在該趨勢的可能，因此有待于更深入驗證研究。

基于上述結論我們進一步結合術前進行微生物培養(yǎng)的結果發(fā)現(xiàn)藏族CRSwNP中更多G+細菌生長，相對在CRSsNP中G-細菌較為顯著，預示著最近文獻報道不同的微生物組可能與某些類型的免疫反應相關[18]。我們初步推斷可疑高原特殊環(huán)境對鼻腔微生物譜系有影響并與平原地區(qū)有所不同，由此高原地區(qū)慢性鼻竇炎免疫炎癥模式有其獨特一面值得深入研究。至于導致CRSwNP免疫表型上存在太大差異，本研究中出現(xiàn)與亞洲人群不同分歧性結果，可能歸因于高原特殊環(huán)境下慢性鼻竇炎鼻腔微生物定植存在某種缺氧性微環(huán)境下致病菌群結構改變導致鼻黏膜炎癥模式的改變。該結論也許可能根本從高原特殊環(huán)境或遺傳基因等各方面所導致值得深入研究，現(xiàn)有種種證據(jù)表明可能因不同致病菌感染或相對惡劣環(huán)境及抗生素使用不規(guī)范等眾多綜合因素結果所致[19-20]。 總之，慢性鼻竇炎免疫表型及炎癥模式在全球范圍，不論地域、種族都表現(xiàn)類似特點。而在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中根據(jù)種族、地域，甚至相同地域不同群體中其免疫及炎癥機制略有差異。通過本研究可能歸功于外來微生物影響當?shù)谻RS中的免疫表型，或許因遺傳、環(huán)境等因素導致其CRS中特有免疫表現(xiàn)形式。故有待于進一步從免疫分子機制遺傳表觀學等方面值得更深入細致研究。

4 結論與啟示

本研究不僅揭示了高原地區(qū)藏族人群慢性鼻鼻竇炎免疫表型特點，其中慢性鼻竇炎伴有鼻息肉具有Th2傾向嗜酸性炎癥模式特征并與革蘭氏陽性菌定植相關，呈現(xiàn)出類似白種人免疫反應趨勢，偏離亞洲人群鼻息肉免疫表性特征。反之，慢性鼻竇炎不伴鼻息肉中以Th1或Th17優(yōu)勢中性粒細胞炎癥趨勢特征；并且與革蘭氏陰性菌存在某種相關性。藏族人群中出現(xiàn)與不同亞洲人群鼻息肉中表現(xiàn)Th2傾向免疫炎癥反應特征，可能因高原特殊環(huán)境導致鼻腔微生物譜系的特殊改變，值得深入研究。