◎ 楊秋玲，季婧涵，黃小方，林曉娟

（南平市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，福建 南平 353000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aernginosa）又稱綠膿桿菌，是一種常見的食源性和水源性致病菌，它極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，對消毒劑、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1-3]。因此，準(zhǔn)確而快速地檢出銅綠假單胞菌，在保障人民飲食用水安全和評價(jià)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰Ψ矫婢惋@得尤為重要。能力驗(yàn)證是一種有效確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的方法，同時(shí)對檢測人員技術(shù)水平的提高和質(zhì)量管理體系的完善起到積極的作用[4]。目前，銅綠假單胞菌的檢測主要采用國標(biāo)法，檢測時(shí)間至少2 d，且對操作人員的技術(shù)要求很高，不利于快速檢測。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于檢測時(shí)間短、操作簡單、且特異性強(qiáng)等優(yōu)勢而被廣泛的運(yùn)用于病毒和食源性致病菌的檢測。參加本次能力驗(yàn)證旨在通過對銅綠假單胞菌的檢測，確定本實(shí)驗(yàn)室具備檢測該菌的能力，同時(shí)通過對比分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR法以及國標(biāo)法的檢測結(jié)果，為今后水中銅綠假單胞菌的快速、高效、準(zhǔn)確檢測提供有價(jià)值的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和標(biāo)準(zhǔn)菌株

樣品18-U262和樣品18-N396，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究測試評價(jià)中心提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌（FSCC 206004）和熒光假單胞菌（GDMCC1.344），均從廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心購買。

1.2 主要儀器

CFX96-Touch Deep WellTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Centrifuge 5418臺式離心機(jī)、CHB-T2-B恒溫金屬浴、ND-ONE-W超微量分光光度計(jì)、2018614渦旋混合器、SHP-350生化培養(yǎng)箱、G154DW立式自動壓力蒸汽滅菌器、HTY-305G微生物限度檢驗(yàn)儀、ZF-1三用紫外分析儀以及AC2-4S1生物安全柜等。

1.3 主要試劑

綠膿桿菌核酸測定試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司；營養(yǎng)肉湯、CN瓊脂及配套試劑、綠膿菌素測定培養(yǎng)基等，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 樣品的制備

將樣品用520 mL無菌水再水化，制成待測樣品原液。取待測樣品原液60 mL加入到540 mL的無菌水中制成1∶10的樣品勻液；按相同的方法制備1∶100、1∶1 000的樣品勻液，備用。

1.5 銅綠假單胞菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

取25 mL待測樣品原液通過孔徑0.45 μm的濾膜過濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至100 mL營養(yǎng)肉湯中，增菌18 h后，取增菌液1.5 mL，13 000 r·min-1離心2 min；棄上清液，沉淀中直接加入100 μL DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min。13 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。DNA的擴(kuò)增根據(jù)上海之江生物科技股份有限公司綠膿桿菌核酸測定試劑盒（熒光PCR法）的說明書進(jìn)行。

1.6 銅綠假單胞菌的國標(biāo)法

根據(jù)GB 8538-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法的銅綠假單胞菌-濾膜法，將250 mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45 μm的濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上,將平板倒置于36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果；同時(shí)做陽性和陰性對照[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測2份待測樣，結(jié)果2份待測樣品均檢出銅綠假單胞菌，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，樣品18-U262和樣品18-N396的樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增出的曲線和內(nèi)部陽性對照樣的曲線一致，F(xiàn)AM通道的Ct值均≤35，說明檢測結(jié)果陽性。

圖1 樣品18-U262和樣品18-N396實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果圖

2.2 國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測結(jié)果

按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016法對2份待測樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果在CN平板上的菌落形態(tài)如下：陽性對照組有藍(lán)綠色菌落生長，陰性對照組有黃綠色菌落生長；樣品18-U262和樣品18-N396的樣品有藍(lán)綠色菌落和其他菌落生長，挑取藍(lán)綠色菌落，通過綠膿菌素試驗(yàn)，被檢物里面均存在綠膿菌素，判定檢測結(jié)果陽性，計(jì)數(shù)所有藍(lán)綠色菌落，結(jié)果見表1。樣品18-U262的報(bào)出值為4 600 CFU/250 mL，樣品18-N396的報(bào)出值為2 200 CFU/250 mL。

表1 CN平板上的銅綠假單胞菌菌落數(shù)表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室通過參加由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心組織和負(fù)責(zé)實(shí)施的對2份礦泉水盲樣中銅綠假單胞菌的檢測能力驗(yàn)證，樣品18-U262的檢測結(jié)果為4 600 CFU/250 mL，樣品18-N396的檢測結(jié)果為2 200 CFU/250 mL，評價(jià)中心按照ISO 13528-2015標(biāo)準(zhǔn)，利用參加實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果計(jì)算了能力評價(jià)統(tǒng)計(jì)量得出本次試驗(yàn)的Z值分別為0.5和0.3，能力評價(jià)準(zhǔn)則結(jié)果|Z|均小于2，評價(jià)結(jié)果滿意，說明本實(shí)驗(yàn)室具有檢驗(yàn)該菌的能力。

在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與國標(biāo)法對銅綠假單胞菌的檢出結(jié)果皆為陽性，該方法與傳統(tǒng)國標(biāo)法相比具有取樣量小，檢測時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，因此，可將qPCR法輔助國標(biāo)法對水中的銅綠假單胞菌進(jìn)行快速檢測和結(jié)果初篩，提高其檢測效率，同時(shí)也為其他微生物的快速、高效、準(zhǔn)確的檢測提供有價(jià)值的參考和借鑒。