◎ 袁荷芳，蔣曉勤，程 妍，倪嘉倩

（常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 常州 213000）

鄰苯二甲酸酯（縮寫(xiě)PAEs），又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱。PAEs是一類能起到軟化作用的化學(xué)品，它被普遍應(yīng)用于玩具、食品包裝、乙烯地板、清潔劑、指甲油、噴霧劑和洗發(fā)水等很多產(chǎn)品中[1]。大量研究表明，PAEs及其代謝產(chǎn)物能夠?qū)θ梭w健康產(chǎn)生不利的影響[2-3]。歐洲安全局、美國(guó)、日本、中國(guó)也都先后將PAEs列入優(yōu)先控制污染物的黑名單，PAEs對(duì)人類健康的危害已經(jīng)引起世界的廣泛關(guān)注。目前，很多含油食品包裝都是使用的都是塑料包裝，由于塑化劑是脂溶性的，很容易遷移至食品中，造成污染。

有關(guān)PAEs測(cè)定方法主要有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）技術(shù)已廣泛用于去除油脂樣品中的脂質(zhì)和色素等干擾物，氣相色譜/質(zhì)譜法是目前對(duì)PAEs較為主要的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)將GPC與GC/MS技術(shù)相結(jié)合，研究了含油食品中16種PAEs的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步了解目前市場(chǎng)上含油食品中PAEs的污染情況，保護(hù)消費(fèi)者健康有著重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

色譜純環(huán)己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)：16080007）；色譜純乙酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)：15030081）；色譜純甲醇（德國(guó)默克，批號(hào)：1826907614）；分析純丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160516）；1 000 mg·L-116種鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)樣，分別為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2戊基）酯、鄰苯二甲酸二(2- 乙氧基己)酯、鄰苯二甲酸二戊酯、鄰苯二甲酸二己酯、鄰苯二甲酸芐丁酯、鄰苯二甲酸二（2-丁氧乙）酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯、鄰苯二甲酸二苯酯、鄰苯二甲酸二正辛酯和鄰苯二甲酸二壬酯，購(gòu)于上海安譜。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

16種鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)樣濃度為1 000 mg·L-1，準(zhǔn)確移取1 mL混標(biāo)，用環(huán)己烷定容至25 mL，配制成40 mg·L-1儲(chǔ)備液。吸取一定量的儲(chǔ)備液，配制成0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。置于4 ℃冰箱中避光保存，有效期3個(gè)月。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CP513電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；WT5002K電子天平（常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WXH-3微型旋渦混合器2800次/分（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；Freestyle全自動(dòng)凝膠滲透色譜-在線濃縮-SPE系統(tǒng)配套固相萃取儀（德國(guó)LCTech）；全自動(dòng)固相萃取儀（睿科儀器有限公司）；7890A-7000GC-MS/MS氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司），配電子轟擊源（EI源）。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm；進(jìn)樣方式：自動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；不分流；分流比：20∶1；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速：1 mL·min-1；進(jìn)洋口溫度：250 ℃；柱溫箱溫度：60 ℃用于 1 min，然后 20 ℃·min-1到 220 ℃，保持1 min，然后5 ℃·min-1到280 ℃，保持4 min，總時(shí)間為30 min。

1.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜：EI電離方式，電離能70 eV；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；GC-MS-MS接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描范圍m/z 50～450；掃描方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；溶劑延遲5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰苯二甲酸酯的提取方法的選擇

2.1.1 超聲提取法

準(zhǔn)確稱取1.0～2.0 g（精確至0.000 1 g）含油試樣，加入色譜純環(huán)己烷10.0 mL，超聲提取10 min，靜置后將上清液全部轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，40 ℃氮吹至近干，后用環(huán)己烷定容至1 mL，上GC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做試劑空白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲提取前處理方法不能有效去除雜質(zhì)干擾，影響目標(biāo)物的測(cè)定。

2.1.2 凝膠色譜凈化法

稱取0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）樣品于15 mL樣品瓶中，加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、環(huán)己烷混合溶液10 mL，渦旋20 s，采用全自動(dòng)凝膠色譜-在線濃縮-SPE系統(tǒng)配套固相萃取儀，用自動(dòng)進(jìn)樣器取5 mL稀釋后的樣品溶液注入GPC，凈化分離后，濃縮定容至2 mL，取1μL供GC-MS/MS分析，同時(shí)做試劑空白。

2.2 凝膠色譜凈化方法的優(yōu)化

2.2.1 凝膠滲透時(shí)間的優(yōu)化

稱取0.5 g食用油，加入16種鄰苯二甲酸酯混標(biāo)，按樣品處理方法進(jìn)行處理。將凝膠色譜柱流出端與濃縮器斷開(kāi)，準(zhǔn)備一個(gè)放廢液的燒杯收集預(yù)淋洗10 s，凈化分離除雜質(zhì)800 s后產(chǎn)生的溶液，之后準(zhǔn)備12個(gè)2 mL收集瓶收集720 s流出液，每60 s收集一份，即每份1 mL，共12份，再用GC-MS/MS測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1份和第12份未檢出鄰苯二甲酸酯。所以最終確定凈化除雜質(zhì)時(shí)間為720 s，主要收集時(shí)間720 s。

2.2.2 凝膠滲透溫度的優(yōu)化

濃縮溫度直接影響了收集液的濃縮速度。研究比較了33、35、37、40、42 ℃和44 ℃對(duì)同一加標(biāo)濃度回收率的影響，發(fā)現(xiàn)在33℃下濃縮的回收率較低，在45%以下。這可能是由于低的溫度使?jié)饪s的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反而損失各組分的回收率。35 ℃和37 ℃下濃縮各組分的回收率明顯升高，兩個(gè)溫度沒(méi)有明顯差別。但隨溫度升高到42 ℃和44 ℃后，各組分回收率隨之降低?？紤]到較高的溫度有機(jī)溶劑蒸發(fā)得快些，可以提高工作效率，故選擇40 ℃為最終濃縮溫度。

2.2.3 濃縮壓強(qiáng)的優(yōu)化

濃縮腔的預(yù)濃縮壓強(qiáng)是指將收集液濃縮到5 mL這階段所用壓強(qiáng)，定容壓強(qiáng)為最后定容階段所用壓強(qiáng)，通常預(yù)濃縮壓強(qiáng)比定容壓強(qiáng)低5 kPa，本研究比較了20～ 22、22～ 24、24～ 26、26～ 28 kPa以 及28～30 kPa等不同預(yù)濃縮壓強(qiáng)-定容壓強(qiáng)組合對(duì)同一加標(biāo)濃度回收率的影響，發(fā)現(xiàn)在隨壓強(qiáng)的升高，各組分回收率相應(yīng)的提高，但當(dāng)預(yù)濃縮壓強(qiáng)為22 kPa，定容壓強(qiáng)為27 kPa達(dá)到穩(wěn)定，再升高壓強(qiáng)對(duì)大部分組分的回收率沒(méi)有影響，有的組分的回收率甚至出現(xiàn)降低，故選擇22 kPa為預(yù)濃縮壓強(qiáng)，27 kPa為定容壓強(qiáng)。

2.3 GC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.3.1 目標(biāo)物母離子的選擇

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜圖選擇豐度較大且相對(duì)分子質(zhì)量適中的碎片離子作為母離子。鄰苯二甲酸二甲酯（m/z）163碎片離子峰相對(duì)豐度最大，鄰苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯（m/z）59碎片離子峰相對(duì)豐度最大，鄰苯二甲酸二（2-乙氧基己）酯（m/z）73碎片離子峰相對(duì)豐度最大，鄰苯二甲酸二苯酯（m/z）225碎片離子峰相對(duì)豐度最大。其余12種鄰苯二甲酸酯的所有碎片離子中（m/z）149的碎片離子峰相對(duì)豐度最大，因此其余12種鄰苯二甲酸酯均選擇（m/z）149作為母離子。然后從中選擇2～3個(gè)碎片離子作為子離子（即為定量離子），12種鄰苯二甲酸酯均選擇（m/z）93、65作為子離子。

2.3.2 定量離子及定性離子的選擇

三重四級(jí)桿可同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，提供具體的分子量信息。一個(gè)母離子經(jīng)過(guò)碰撞會(huì)得到一些子離子，而其中有比較穩(wěn)定的，且峰度比較強(qiáng)的，可以選擇作為定量離子，同時(shí)它也可以是定性離子。因?yàn)橐粋€(gè)定量離子對(duì)還不能達(dá)到定性的鑒定點(diǎn)數(shù)，所以再選擇兩個(gè)離子對(duì)作為輔助定性的離子。

2.3.3 目標(biāo)物碰撞電壓的優(yōu)化

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜在掃描過(guò)程中，一般選取m/z大、信號(hào)強(qiáng)的離子作為前級(jí)離子，產(chǎn)物離子則選擇前級(jí)離子裂解后產(chǎn)生的特征離子。本文分別通過(guò)全掃模式（scan）和產(chǎn)物離子掃描（Product-ion scan）確定組分的前級(jí)離子和特征產(chǎn)物離子，對(duì)前級(jí)離子生成產(chǎn)物離子過(guò)程中所需的電壓進(jìn)行優(yōu)化，找到最佳的碰撞能量。

對(duì)于三重四極桿掃描質(zhì)譜，其掃描速度和掃描時(shí)間也是影響其掃描結(jié)果的重要的因素。當(dāng)掃描速度加快時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)采集的點(diǎn)數(shù)會(huì)增多，色譜峰模擬狀況就越好，但掃描速度過(guò)快，相應(yīng)的離子采集效率降低，噪聲會(huì)變大，重現(xiàn)性降低。每個(gè)色譜峰最佳質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)為10～15個(gè)點(diǎn)，根據(jù)色譜峰的峰寬除以質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)可以得到合適的質(zhì)譜掃描時(shí)間，以確定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）的參數(shù)。

2.4 空白干擾

在前處理過(guò)程和正常的色譜分析條件下，空白樣品中鄰苯二甲酸酯很可能出峰，分析其來(lái)源可能有3個(gè)方面：①樣品前處理操作過(guò)程中容器污染。②儀器管路污染。③進(jìn)樣隔墊、樣品瓶隔墊及進(jìn)樣針等引入污染。

針對(duì)以上原因，采用了如下3個(gè)步驟控制空白：①容器空白。實(shí)驗(yàn)用到的所有器皿在每次使用之前均用色譜純環(huán)己烷清洗3遍。②采用體積比為1∶1的乙酸乙酯、環(huán)己烷混和溶劑清洗GPC管路。③采用超高惰性隔墊，工作曲線最高濃度點(diǎn)與樣品之間加2個(gè)溶劑樣品用于洗針。通過(guò)上述步驟，鄰苯二甲酸酯空白出峰問(wèn)題得到了有效控制。

2.5 方法的評(píng)價(jià)

2.5.1 鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程及相關(guān)系數(shù)

鄰苯二甲酸酯儲(chǔ)備液用環(huán)己烷稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定方法的線性范圍及相關(guān)系數(shù)R2。

2.5.2 方法準(zhǔn)確度和精密度

將低、中、高不同質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白樣中，分別制成100、1 000 μg·kg-1的加標(biāo)樣品，同時(shí)做空白樣品實(shí)驗(yàn)。每個(gè)水平平行做6次，回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品加標(biāo)回收率及精密度表

續(xù)表1

3 實(shí)際樣品分析與討論

用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)抽查的50個(gè)食用油及含油樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出4個(gè)陽(yáng)性樣品。16種鄰苯二甲酸酯中檢出3種，分別是DIBP、DBP和DEHP，這3種化合物都是歐盟REACH法規(guī)高度關(guān)切物質(zhì)清單中的化合物，是目前我國(guó)使用較為廣泛的增塑劑，陽(yáng)性樣品檢出值見(jiàn)表2。

表2 陽(yáng)性樣品檢出值表

歐盟令2007/19/EC和我國(guó)GB 9685-2008均規(guī)定了DBP和DEHP在食品中的特定遷移限量為1.5 mg·kg-1和0.3 mg·kg-1（目前DIBP還沒(méi)有限量規(guī)定），因此有3個(gè)樣品超過(guò)限量要求。出現(xiàn)這種情況有可能是原材料所處的生長(zhǎng)環(huán)境空氣、灌溉水和土壤中含有鄰苯二甲酸酯類，整個(gè)采集、運(yùn)輸、加工、儲(chǔ)藏過(guò)程中與含有鄰苯二甲酸酯類的塑料管道或其他環(huán)境相接觸，特別是儲(chǔ)藏容器和產(chǎn)品包裝中如果含有鄰苯二甲酸酯類，長(zhǎng)時(shí)間接觸都很有可能把鄰苯二甲酸酯類遷移到含油食品中。

本研究采用凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)含油中16種鄰苯二甲酸酯進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法在0～16 mg·kg-1范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2在0.998 64～0.999 22。含油脂樣品中16種鄰苯二甲酸酯的加標(biāo)回收率為84.85%～107.45%；方法檢出限為100～200 μg·kg-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在2.0%～5.0%。本方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、重復(fù)性較好，該方法的準(zhǔn)確度符合食品中痕量物質(zhì)檢測(cè)要求，可應(yīng)用于含油脂食品中16種鄰苯二甲酸酯的實(shí)際檢測(cè)分析。