鄧蔡 張麗 歷丹 桂婷 冷衛(wèi)東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心牙周科，湖北 十堰 442000)

牙周病是成人牙齒功能喪失的主要原因，同時還與部分系統(tǒng)性疾病有關(guān)，對口腔及全身健康均有較大的影響[1]。牙周組織生理性和功能性的完全再生是治療此類疾病的最終目標(biāo)，但由于牙周解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，目前還未出現(xiàn)完全有效的治療方案[2-3]?；诟杉?xì)胞技術(shù)的組織工程是牙周再生研究的新方向，目前首選種子細(xì)胞是牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stemcells，PDLSCs)[4]，但其需要拔牙才能獲得，應(yīng)用受到限制。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)同為牙源性種子細(xì)胞，獲得更為方便，本研究重點探討GMSCs作為牙周再生種子細(xì)胞的可行性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細(xì)胞培養(yǎng)試劑：α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS，均購自美國Hyclone；0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜 DMSO、維生素C-二磷酸鹽、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、吲哚美辛，均購自美國Sigma；Dispase，購自美國Roche；L-谷氨酰胺，購自美國Gibco；青、鏈霉素(華北制藥)。轉(zhuǎn)染試劑：eFGP慢病毒載體，購自廣州賽業(yè)生物科技；潮霉素，購自美國Sigma。膜片及模型制備試劑：EDTA凝膠、戊巴比妥鈉、氯已定含漱液、阿替卡因腎上腺素注射液，均為國產(chǎn)；自制0.5%氯化血紅素-維生素K1溶液、牛心腦浸液液體培養(yǎng)基、15%EDTA脫鈣液。檢測試劑：兔抗人多克隆GFP抗體，購自美國Cell signaling；免疫檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、DAPI染色液，購自北京中杉金橋生物；多聚賴氨酸粘片劑，購自美國Sigma；蘇木素、伊紅、二甲苯、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，購自德國HERAcell；倒置相差攝像顯微鏡，購自德國leica；低速臺式大容量離心機、臺式高速離心機、分光光度計，均購自德國Eppendorf；流式細(xì)胞分析儀，購自美國Beckman；超低溫冰箱，購自美國Thermo Forma；厭氧菌培養(yǎng)箱，購自英國RUSKINN；麥?zhǔn)媳葷醿x，購自美國BD；漩渦振蕩器，購自上海滬西分析儀器廠；全自動脫水機，購自英國SHANDON；偏振光顯微鏡，購自日本Olympus。

1.3 動物材料 雄性比格犬4只，體重(9±1.7)kg，9～12月齡，由同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 分離GMSCs和PDLSCs 征得患者同意后，采集牙周健康患者廢棄的小塊牙齦組織及健康前磨牙，原代培養(yǎng)GMSCs和PDLSCs，當(dāng)細(xì)胞克隆生長達到培養(yǎng)瓶70%～80%后，以0.25%胰酶消化傳代。當(dāng)長梭形細(xì)胞胞質(zhì)回縮為圓形時，終止消化。然后制備單細(xì)胞懸液。1：1傳代，使細(xì)胞均勻鋪于瓶底生長。當(dāng)P1代細(xì)胞占瓶底的80%～90%后，再次將其制備為單細(xì)胞懸液，計數(shù)。隨后將細(xì)胞懸液稀釋至10個細(xì)胞/ml，接種到96孔板，100μl/孔，植入5%CO2、37℃孵育24h。于倒置顯微鏡下挑選并標(biāo)記只含單個細(xì)胞的孔，加入培養(yǎng)液200μl培養(yǎng)。至30%～50%孔底面積被細(xì)胞鋪滿時，消化分離，獲得具有自我更新能力的GMSCs和PDLSCs。

1.4.2 制備可穩(wěn)定表達eGFP的GMSCs和PDLSCs 首先獲得慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)最佳MOI值：制備P3代GMSCs和PDLSCs均勻細(xì)胞懸液，以103個/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板，培養(yǎng)24h。采用無血清無雙抗的α-MEM培養(yǎng)基將病毒梯度稀釋至MOI分別為0、10、20、40、60、80、100、200，加入96孔板。在5%CO2、37℃飽和濕度下孵育。在熒光顯微鏡下持續(xù)觀察細(xì)胞生長狀況及綠色熒光蛋白表達情況，確定最佳MOI值。隨后以最佳MOI再次轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8h后換用含10%FBS的新鮮α-MEM培養(yǎng)基，48h后換含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達eGFP的細(xì)胞。

1.4.3 制備GMSCs和PDLSCs膜片 將能夠穩(wěn)定表達eGFP的P4代GMSCs和PDLSCs吹打為單細(xì)胞懸液，均勻接種至培養(yǎng)皿，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，細(xì)胞充分貼壁伸展后加入膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液。至倒置顯微鏡下課觀察到底部邊緣出現(xiàn)細(xì)胞褶皺后結(jié)束培養(yǎng)。

1.4.4 動物模型制備 4只雄性比格犬均選擇雙側(cè)下頜第2、3、4前磨牙(P2、P3、P4)作為手術(shù)牙位制備模型。首先以我院臨床中重度慢性牙周炎患者為取材對象，培養(yǎng)牙周來源的混合厭氧菌，培養(yǎng)至菌液濃度1.5×109CFU/ml后應(yīng)用。隨后手術(shù)暴露P2、P3、P4唇舌側(cè)骨板，翻瓣后磨除根分叉區(qū)牙槽骨，制備冠根向約5mm缺損，磨除牙根處牙槽骨。蘸取混合菌液70μl，置于缺損內(nèi)，縫合粘骨膜瓣。模型建立約2周后，可觀察牙齦紅腫，探診出血，提示成功建立牙周炎Ⅲ度根分叉病變模型。開展牙齦基礎(chǔ)治療，并每日采用復(fù)方氯已定含漱液進行口腔衛(wèi)生護理。

1.4.5 分組及膜片植入 每只比格犬單側(cè)3顆患牙分別采用植入GMSCs膜片(GMSCs組)、PDLSCs膜片(PDLSCs組)，或不植入膜片(空白對照組)。保證單側(cè)3顆患牙處理方案不同、雙側(cè)同名牙處理方案不同。細(xì)胞膜片植入根分叉骨缺損區(qū)，術(shù)后3d給予5萬單位/kg青霉素肌注，每天2次，每日繼續(xù)應(yīng)用復(fù)方氯已定含漱液，直至10天后拆線。拆線后每2～3天應(yīng)用復(fù)方氯已定含漱液。

1.4.6 標(biāo)本處理 膜片植入8周后，處死比格犬，取出實驗牙及周圍組織，脫鈣后將每顆牙齒以近遠(yuǎn)中方向自牙體中央切成頰側(cè)、舌側(cè)兩部分，分別包埋、制備3μm厚切片備用。

1.5 觀察項目

1.5.1 HE染色 隨機選取每個標(biāo)本中的3張切片，經(jīng)常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變，測量如下指標(biāo)：缺損高度、新生牙骨質(zhì)百分比、新生骨面積百分比。其中新生牙骨質(zhì)百分比指根分叉區(qū)新生牙骨質(zhì)長度占牙根的比例；新生骨面積百分比指新生小梁骨占根分叉區(qū)缺損總面積的百分比。

1.5.2 天狼星紅染色 隨機選取每個標(biāo)本中的3張切片，開展天狼星紅-苦味酸試驗，在偏光顯微鏡下觀察新生牙周膜中的膠原纖維。評價標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ型，指膠原纖維緊密排布，雙折光性強，纖維顏色呈黃色或紅色；Ⅱ型指膠原纖維雙折光性弱，排布呈疏松網(wǎng)狀，顏色不固定；Ⅲ型指膠原纖維雙折光性弱，呈綠色的細(xì)纖維；Ⅳ型指僅可見顯示弱雙折光的基膜，呈淡黃色。

1.5.3 免疫組化分析 切片標(biāo)本采用免疫組化二步法檢測GFP在新生牙周組織中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 3組HE染色結(jié)果比較 兩種干細(xì)胞膜片植入后，根分叉區(qū)均有明顯的牙槽骨和骨質(zhì)再生，但新生牙骨質(zhì)較薄，基質(zhì)內(nèi)含有豐富的牙骨質(zhì)細(xì)胞。空白對照組牙槽骨和牙骨質(zhì)再生較少。3組骨缺損高度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PDLSCs組和GMSCs組新生牙骨質(zhì)百分比、新生骨面積百分比均明顯高于空白對照組，但PDLSCs組與GMSCs組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 HE染色結(jié)果分析Table 1 Analysis of HE staining resulfs

注：與空白對照組相比，①P<0.05

2.2 3組天狼星紅染色結(jié)果比較 GMSCs組：新生牙周纖維粗大，多垂直插入新生牙骨質(zhì)，具備Sharpey’s纖維特征，偏振光顯微鏡下牙周韌帶纖維主要為Ⅰ型，見圖1A；PDLSCs組：與GMSCs組基本一致，見圖1B；空白對照組：新生牙周韌帶主要水平向插入新生牙骨質(zhì)，不具備Sharpey’s纖維特征，偏振光顯微鏡下牙周韌帶纖維主要為Ⅰ型和Ⅲ型，見圖1C。

圖1 三組天狼星染色結(jié)果圖Figure 1 Three sets of sirius staining results

注：A.高倍偏振光顯微鏡下，牙周再生韌帶主要為橙色，且多以>60°方向插入新生牙骨質(zhì)；B. 高倍偏振光顯微鏡下，牙周再生韌帶主要為橙色，且多以>60°方向插入新生牙骨質(zhì)；C. 高倍偏振光顯微鏡下，牙周再生韌帶主要為橙色或綠色，且多以<60°方向插入新生牙骨質(zhì)

2.3 3組免疫組化結(jié)果比較 采用免疫組化分析檢測再生組織中GFP紅染骨細(xì)胞的表達，結(jié)果顯示GMSCs組、PDLSCs組紅染骨細(xì)胞占比接近，且均明顯高于空白對照組(P<0.05)，見表2。

表2 3組免疫組化分析結(jié)果Table 2 3 sets of immunoassay resuts

注：與空白對照組相比，①P<0.05

3 討論

PDLSCs是研究較廣泛的牙周再生組織工程種子細(xì)胞，已有較多研究證實了其具備良好的牙周組織再生潛能。袁萍等[5]研究顯示，PDLSCs可表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1和CD146，且來源于牙周炎患者的PDLSCs具備更強的增殖潛能，但其成骨分化能力下降；體外培養(yǎng)鼠PDLSCs具備良好的增殖活性和礦化能力，但性能差于根尖乳頭干細(xì)胞[6-7]；安康康等[8]研究顯示，PDLSCs具備良好的成骨和成脂分化能力。但該細(xì)胞來源有限，獲取困難，并不適宜于臨床大規(guī)模應(yīng)用。

GMSCs同為牙周組織來源，其具備取材方便、易培養(yǎng)的優(yōu)勢，部分研究也證實其具備良好的成骨能力。研究顯示GMSCs具備良好的成骨和成脂能力，且堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠抑制其的成骨能力、促進其成脂能力[9-10]；陳巖等[11]研究顯示GMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后具備礦化能力，且根端牙胚條件培養(yǎng)液能夠誘導(dǎo)其分化。本研究結(jié)果與之一致，也觀察到GMSCs膜片能夠有效促進牙周組織再生。

為了有效對比觀察2種膜片移植后在生物體內(nèi)的增殖及分化情況，本研究對所移植細(xì)胞膜片進行了eGFP標(biāo)記，再利用熒光顯微鏡能夠有效觀察到GMSCs和PDLSCs在體內(nèi)的增殖和分化情況。2種細(xì)胞膜片組根分叉組織缺損區(qū)均有新生牙骨質(zhì)、牙周膜和骨組織形成，而空白對照組幾乎不能觀察到上述新生組織。植入細(xì)胞膜片后，大部分新生牙槽骨在顯微鏡下呈橙色表達，這說明再生的牙周纖維主要為Ⅰ型，且天狼星紅染色顯示，可靠到多數(shù)膠原纖維垂直或接近垂直地插入新生牙骨質(zhì)，而空白對照組牙周纖維束多與牙根面平行，并不具備正常功能，提示細(xì)胞膜片對新生牙周圍韌帶具有調(diào)節(jié)作用[12-14]。免疫組化結(jié)果顯示，植入細(xì)胞膜片后，大部分新生的牙周組織來源于植入的可穩(wěn)定表達GFP的干細(xì)胞，上述結(jié)論均提示GMSCs與PDLSCs一樣，能夠形成牙周膜、牙槽骨可牙骨質(zhì)。但免疫組化結(jié)果也表明，并非所有的再生組織都能表達綠色熒光蛋白，這說明機體內(nèi)源性前體細(xì)胞也參與修復(fù)了牙周缺損。由此可推測，GMSCs和PDLSCs具備2種促牙周組織再生能力，可直接分化為牙周組織，對宿主內(nèi)源性前體細(xì)胞有間接調(diào)控途徑。研究也證實PDLSCs能夠激活機體Wnt信號通路，從而調(diào)控其他細(xì)胞的分化[15-18]?？傊?，GMSCs與PDLSCs細(xì)胞膜片均能夠有效促進牙周再生，基于獲得方便性上進行對比，采用GMSCs更具優(yōu)勢[19-20]，具備更廣泛的應(yīng)用空間。

4 結(jié)論

本研究顯示PDLSCs細(xì)胞膜片能夠有效促進牙周再生，但其獲得相對困難；GMSCs的促牙周再生能力于PDLSCs相近，且獲得更為方便。