鄔亭亭 魏強(qiáng) 郭述良 劉平 羅永艾

(1．成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610031；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016；3．成都市天府新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)二科，四川 成都 610213；4．重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶401220)

作為全球結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，我國(guó)結(jié)核疫情依然嚴(yán)峻。近年來(lái)分枝桿菌噬菌體在結(jié)核診斷及治療研究中取得巨大突破[1-3]，為結(jié)核病的防治帶來(lái)曙光。但是有研究[4]發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌噬菌體基因組中包含一些外來(lái)基因。噬菌體將一個(gè)細(xì)菌的基因?qū)氲搅硪粋€(gè)細(xì)菌的現(xiàn)象為細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)將分枝桿菌基因組中的某些與疾病相關(guān)的外來(lái)基因注入宿主菌基因組中，可能與人類疾病相關(guān)。而溶原性噬菌體是此過(guò)程最重要的媒介。因此，測(cè)序分枝桿菌噬菌體33D全基因組，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，全面認(rèn)識(shí)33D基因遺傳背景，排除溶原性噬菌體和含有致病基因的噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法治療結(jié)核分枝桿菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌及噬菌體 恥垢分枝桿菌 mc2155由王國(guó)治教授(中國(guó)食品藥品檢定研究院)贈(zèng)送；分枝桿菌噬菌體33D由Félix d’Hérelle噬菌體中心(加拿大拉瓦爾大學(xué))惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 OADC增菌液(美國(guó)sigma公司)，羅氏培養(yǎng)基(中國(guó)珠海貝索公司)，7H9/7H10培養(yǎng)基(美國(guó)BD公司)，λ噬菌體基因組提取試劑盒(中國(guó)北京艾比根生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體擴(kuò)增 7H9/7H10瓊脂培養(yǎng)法培養(yǎng)48 h，在平皿中加5ml緩沖液，孵育1～2 h，回收全部緩沖液，0.2μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾液體除菌。

1.2.2 噬菌體DNA提取 使用λ噬菌體基因組提取試劑盒提取噬菌體33D DNA，具體操作參照說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)DNA含量及純度，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)OD260/OD280 比值，達(dá)1.7～1.9符合酶切和測(cè)序要求。

1.2.3 噬菌體33D基因組DNA限制性酶切及凝膠電泳 酶切：取合格的33D噬菌體DNA樣本，做單酶切。瓊脂糖凝膠電泳：參照文獻(xiàn)[5]，制備瓊脂糖凝膠電泳。以Marker和未酶切的33D DNA作為對(duì)照。

1.2.4 鳥槍法測(cè)序 北京六合華大基因科技股份有限公司采用鳥槍法完成測(cè)序反應(yīng)和序列拼接。測(cè)序得到的DNA序列采用Phred/PhraD/Consed軟件包組裝，PCR擴(kuò)增連接重疊群(contig)間的缺口。

1.2.5 噬菌體33D基因組序列信息 用DNAStar軟件包分析33D 的全基因組長(zhǎng)度、基因平均長(zhǎng)度和密度、GC含量、編碼氨基酸平均長(zhǎng)度和密度。

1.2.6 噬菌體33D基因預(yù)測(cè) 使用Glimmer3.0軟件預(yù)測(cè)33D基因

1.2.7 基因功能注釋 通過(guò)蛋白序列比對(duì)進(jìn)行基因注釋。使用BLAST(blastall 2.2.21)將基因的序列與各數(shù)據(jù)庫(kù)swissport(版本號(hào)：Release 56.1)，nr(版本號(hào)：2010016)，kegg(版本號(hào)：Release 54)，cog(版本號(hào)：20090331)進(jìn)行同源比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體33D基因組酶切圖譜 用BamHI、EcoRI、HindIII對(duì)33D的基因組進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，見圖1。BamHI能切開33D DNA，表明33D基因組為雙鏈DNA。

2.2 噬菌體33D基因組DNA的制備 經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)噬菌體33D的DNA OD260/OD280為1.80～1.90，濃度大于200 ng/μl，滿足測(cè)序要求。33D DNA脈沖場(chǎng)電泳見圖2。

2.3 噬菌體33D基因文庫(kù)的構(gòu)建 文庫(kù)送檢結(jié)果見表1。

圖1 噬菌體33D DNA酶切電泳圖

Figure1Electrophoresisof33DDNAdigestedwithBamHI,HindIIIandEcoRI

注：1.噬菌體33D DNA被BamHI酶切條帶(5μL); 2.噬菌體33D DNA; 3.噬菌體33D DNA被HindIII酶切條帶(5μL); 4.噬菌體33D DNA被EcoRI酶切條帶(5μL); 5. λDNA/HindIII對(duì)照

圖2 噬菌體33D DNA脈沖場(chǎng)電泳Figure 2 Pulsed field gel electrophoresis of Phage 33D DNA注：1.噬菌體33D 基因組; 2.噬菌體Legendre基因組;3.對(duì)照

2.4 菌噬菌體33D基因組序列特性 噬菌體33D全基因組全長(zhǎng)50036 bp，為線性dsDNA，平均GC含量67.91%。采用Glimmer3.0基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)噬菌體33D共有84個(gè)假定基因，基因總長(zhǎng)度為45735 bp，平均基因密度為0.91，平均基因DNA長(zhǎng)度為544.46 bp。這些推定基因共編碼15161個(gè)氨基酸，每個(gè)氨基酸平均長(zhǎng)度180.49個(gè)氨基酸。

表1 噬菌體33D文庫(kù)質(zhì)檢Table 1 Quality of Phage 33D Genomic Library

2.5 噬菌體基因預(yù)測(cè)及注釋 Glimmer3.0軟件分析預(yù)測(cè)了33D有84個(gè)假定基因。基因定位、氨基酸大小等信息見表2。通過(guò)BLAST同源檢索對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)33D有72個(gè)基因編碼序列與噬菌體TM4的基因編碼序列高度匹配，可歸為TM4噬菌體一簇。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)17個(gè)基因功能的明確。與噬菌體DNA復(fù)制相關(guān)基因：Gene 6、7、8、9和gene 14；與調(diào)節(jié)相關(guān)基因：gene 28；gene47 和gene 48編碼裂解酶；噬菌體的結(jié)構(gòu)基因：gene57、 59、60、61、64、70、74、75和gene 76。確定噬菌體33D為烈性噬菌體，未發(fā)現(xiàn)存在致病基因。噬菌體33D的motif-3基序的氨基酸序列與TM4 標(biāo)尺蛋白中motif-3模塊完全一致，見圖3。噬菌體33D基因分布和功能見表2和圖4。

基因基因位置起始位置結(jié)束位置起始密碼子氨基酸大小最匹配蛋白質(zhì)推測(cè)基因功能47-2222723429ATG42.33TM4_gp30LysinB48-2342925072ATG58.58TM4_gp29LysinA/Amidase49-2506925194ATG4.47TM4_gp2850-2520125581GTG12.7TM4_gp2751-2573625972TTG8.8552-2598726541ATG17.63TM4_gp2553+2651626956GTG11.7754-2700727291ATG10.51TM4_gp2455-2734829702GTG81.88TM4_gp2356-2968629940GTG9.49TM4_gp2257-2994531021ATG38.11TM4_gp21Minor tail subunit 58-3111431578ATG17.03TM4_gp2059-3157833341GTG65.63TM4_gp19Minor tail subunit 60-3333234450ATG42.35TM4_gp18Minor tail subunit61-3455638173ATG125TM4_gp17 tape-measure protein62-3819338636ATG16.2763-3866639115ATG16.55TM4_gp1564-3922539839ATG22.19TM4_gp14Major tail subunit65-3999640415GTG15.05TM4_gp1366-4041240684ATG9.8TM4_gp1267-4066541015ATG12.94TM4_gp1168-4101541401ATG13.81TM4_gp1069+4140041516ATG3.8470-4151342430ATG31.8TM4_gp9Major head subunit71-4248543045ATG19.64TM4_gp872-4313143316ATG6.71TM4_gp773-4331344833ATG55.79TM4_gp674-4481446301GTG54.04TM4_gp5Putative portal protein75-4633247423ATG38.97TM4_gp4Putative terminase 76-4748247754ATG9.72TM4_gp4Putative terminase77-4797048182ATG7.59TM4_gp278-4818448318ATG4.63TM4_gp179-4772947980ATG8.49TM4_gp380-4857048851GTG10.7TM4_gp9181-4884549015ATG6.15TM4_gp9082-4902849324ATG10.47TM4_gp8983-4933549571ATG8.48TM4_gp8784-4974549978ATG8.24TM4_gp91

圖3 噬菌體TM4、Halo和33D標(biāo)尺蛋白motif-3模體的氨基酸序列比對(duì)圖Figure 3 Sequence alignments of motif-3 in phage tape-measure proteins注：a.噬菌體TM4; b.噬菌體33D; c.噬菌體 Halo.

圖4 分枝桿菌噬菌體33D基因組注釋圖Figure 4 Genome map of mycobacteriophage 33D注：彩色方塊標(biāo)示預(yù)測(cè)基因；彩色方塊下方注釋基因功能；彩色方塊上注釋基因號(hào)

3 討論

本研究對(duì)噬菌體33D進(jìn)行全基因組的測(cè)序和生物信息學(xué)分析，明確該株噬菌體的遺傳信息，排除溶源性噬菌體和含有致病基因的噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法抗結(jié)核分枝桿菌感染的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

噬菌體33D的基因密度均大于90%，全基因組大小50036bp，符合原核生物基因密度高，基因組小的特點(diǎn)。與之前報(bào)道的和我們測(cè)序的其他分枝桿菌噬菌體基因組大小41901～164602bp一致[6-10]。測(cè)序結(jié)果顯示33D為線性雙鏈DNA，與限制性酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

33D 84個(gè)推定基因中有72個(gè)與分枝桿菌噬菌體TM4的基因高度匹配，可以歸為TM4一簇[7]。33D有17個(gè)基因的編碼產(chǎn)物與已知功能的蛋白質(zhì)同源。末端酶與雙鏈病毒病毒包裝和基因剪切相關(guān)，許多雙鏈?zhǔn)删w均有此酶[11-13]。噬菌體33D編碼末端酶的是gene 75和gene 76。噬菌體感染宿主菌，利用末端酶的大、小亞基將單個(gè)基因組插入衣殼蛋白中[14]。噬菌體33D編碼尾部蛋白的基因有g(shù)ene 57、59、60、61和gene64。對(duì)比噬菌體Halo的gene 16和TM4的gene 17編碼的標(biāo)尺蛋白，發(fā)現(xiàn)33D的gene 61編碼的尾部標(biāo)尺蛋白含有Motif 3基序。Motif 3[4,15-16]與Rpf相似是一種肽聚糖水解酶基序。Rpf能促進(jìn)結(jié)核休眠菌復(fù)蘇通過(guò)水解結(jié)核菌細(xì)胞壁肽聚糖[17-21]。休眠菌是結(jié)核病復(fù)發(fā)和惡化的重要原因[22]。Pedulla等[4]和我們的前期實(shí)驗(yàn)[16]發(fā)現(xiàn)具有Motif 3基序的噬菌體TM4能促進(jìn)結(jié)核休眠菌復(fù)蘇，并最終將其殺滅。我們推測(cè)同噬菌體TM4一樣33D具有殺滅結(jié)核休眠菌的潛力。此外，噬菌體的尾絲蛋白還與噬菌體對(duì)宿主菌受體選擇性結(jié)合相關(guān)[23]。

同D29、TM4的裂解模塊相同，33D的裂解模塊也包括Lysin A和Lysin B。33D的gene48編碼溶菌酶Lysin A。gene 47編碼溶菌酶Lysin B。溶菌酶是雙鏈DNA噬菌體生物合成末期產(chǎn)生的一類蛋白，可通過(guò)溶解肽聚糖[24]和甘露糖[25]，破壞分枝桿菌細(xì)胞壁，裂解細(xì)菌。溶原性噬菌體在感染細(xì)菌后通過(guò)自身整合酶將基因組插入宿主基因組中，并表達(dá)阻遏蛋白，使噬菌體保持溶原狀態(tài)[26]，通常不能裂解宿主。除此之外，溶原性噬菌體存在安全性隱患，其整合酶可將外源基因整合到真核細(xì)胞中。烈性噬菌體是天然的殺菌物質(zhì)，從殺菌效果及安全性雙重考慮噬菌體雞尾酒療法的候選噬菌體只能是烈性噬菌體。本研究確定33D噬菌體同TM4一致為烈性噬菌體，未發(fā)現(xiàn)阻遏蛋白樣基因，亦未發(fā)現(xiàn)明顯的致病基因。

通過(guò)測(cè)序及生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)分支桿菌噬菌體33D的基因組與TM4高度匹配，為TM4簇。我們前期研究[10]33D生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在噬菌體的制備還是在裂解能力及對(duì)耐藥MTB的寬噬率等諸多方面，噬菌體33D都要優(yōu)于TM4。因此，我們有理由相信噬菌體33D具備良好的抗結(jié)核潛力。

4 結(jié)論

噬菌體33D為裂解性噬菌體，33D噬菌體基因組無(wú)致病基因，具有抗結(jié)核潛力，可作為“雞尾酒療法”的候選噬菌體。