武曉慧 楊蕙宇 王軻 寧曉霞 黃振鵬 李蓉 徐玉喬

(1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安 710032)

2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一類慢性、代謝性疾病，可引起多種急、慢性并發(fā)癥，給社會(huì)帶來(lái)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。該病主要發(fā)生于中老年人群, 據(jù)報(bào)道有87%的DM患者是在40歲以后發(fā)病[1]。隨著我國(guó)人均期望壽命的延長(zhǎng)，老年人口數(shù)量逐漸增多，我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)[2]。目前我國(guó)成人2型糖尿病患病率已達(dá)10.4%以上，而60歲以上老年人群患病率則高達(dá)20%以上，患病人口數(shù)量巨大，患病率與年齡密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)主要與遺傳、年齡積累的蛋白質(zhì)糖基化增加[4]、不良生活方式、肥胖等有關(guān)。在這些中老年的DM患者中，有74.1%存在不同程度的肥胖[1]。因而老年性糖尿病的發(fā)生可能與脂肪細(xì)胞代謝或分化異常有關(guān)。年齡相關(guān)的糖耐量減退和2型糖尿病，其具體機(jī)制仍不十分明確。本實(shí)驗(yàn)擬觀察性成熟期(6周齡)，中年期(20周齡)及老年期(40周齡)小鼠的背部棕色脂肪、附睪脂肪、皮下脂肪、腹股溝脂肪及內(nèi)臟脂肪(腸系膜脂肪)的組織學(xué)特點(diǎn)及相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)，探索隨著年齡增加，脂肪組織的變化以及此種變化與小鼠糖耐量之間的關(guān)系，為深入了解和治療年齡依賴的胰島素抵抗、糖耐量減退和老年性糖尿病提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與處理方案 分期分批從空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買C57BL/6J雄鼠，分別飼養(yǎng)至40周齡、20周齡，與6周齡小鼠同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠飼養(yǎng)在西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房，每日給予12h光照，自由采食飲水，采用輻照后全價(jià)營(yíng)養(yǎng)小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料(含5%脂肪，江蘇協(xié)同)進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為三組，老年組(40周齡)，中年組(20周齡)，青年組(6周齡)，每組隨機(jī)選取6只小鼠，稱量體重。在進(jìn)行空腹血糖實(shí)驗(yàn)和糖耐量實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠空腹16h后尾靜脈采血測(cè)空腹血糖值，隨后腹腔注射5%葡萄糖(1g/kg體重)，在注射后30，60，90，120min分別采血測(cè)血糖，將各時(shí)間點(diǎn)的血糖值繪制成糖耐量曲線并計(jì)算曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)。血糖測(cè)定采用羅氏活力型血糖儀及血糖試紙進(jìn)行。在耐冷實(shí)驗(yàn)中，將小鼠置于4℃環(huán)境中，自由采食飲水，采用電子體溫計(jì)測(cè)量冷暴露前的基礎(chǔ)核心體溫(肛溫)，并每隔1h測(cè)量一次，冷處理共計(jì)5h。

斷頸法處死小鼠，將小鼠的雙側(cè)附睪脂肪墊完整取出，稱重，并計(jì)算其與體重的比值。收集小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪、附睪脂肪、背部皮下脂肪、腹股溝區(qū)皮下脂肪以及腸系膜脂肪，保存于-80℃冰箱備用或用4%甲醛溶液固定。

1.2 組織學(xué)分析 小鼠各部位脂肪組織用4%甲醛溶液常規(guī)固定48h，脫水、包埋、切片(厚度3μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，萊卡DM2500光學(xué)顯微鏡觀察并拍照(200×或400×)。

1.3 Realtime RT-qPCR檢測(cè)背部棕色脂肪、附睪脂肪、皮下脂肪、腹股溝脂肪及腸系膜脂肪組織標(biāo)志物mRNA 檢測(cè)棕色和米色脂肪共有的標(biāo)志物(Ucp1、Prdm16、Cidea)、米色脂肪特有的標(biāo)志物(CD137)及線粒體標(biāo)志物細(xì)胞色素C(Cytc)的基因表達(dá)情況。采用2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量(40周齡組及20周齡組相對(duì)于6周齡組的表達(dá)量)，采用小鼠GAPDH作為內(nèi)參。具體步驟：Trizol法提取各部位脂肪組織總RNA，cDNA 合成采用PrimeScript RT Master Mix (RR036A；Takara，日本) 催化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在TB Green Premix Ex Taq II催化下(RR820A；Takara)，在96孔PCR儀上進(jìn)行(C1000 Touch Thermal Cycler； Bio-Rad，美國(guó))。PCR程序: 95°C 預(yù)變性30s, 95°C變性5s，60°C退火、延伸30s，45個(gè)循環(huán)，引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

1.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用液氮冷凍組織并研成粉末，加入RIPA裂解液(碧云天，臨用前加PMSF)充分裂解組織，提取總蛋白。采用8%或15%的SDS-Page凝膠電泳分離蛋白。100V電轉(zhuǎn)至PVDF膜并用5%脫脂奶粉封閉1h。一抗：anti-Ucp1(兔抗，1:1000；ab10983；Abcam，美國(guó))，anti-β-tubulin (鼠抗，1:1000；KM9003T；天津三箭)，4度孵育過(guò)夜，二抗為辣根酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG (1:5000；ZDR-5306；ZDR-5307；北京中杉金橋) 孵育1h，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，采用柯達(dá)X光膠片采集信號(hào)。

表1 Realtime RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence of Realtime RT-qPCR

1.5 相關(guān)性分析 采用Excel 2010對(duì)小鼠背部棕色脂肪、皮下和腹股溝Ucp1相對(duì)表達(dá)量平均值與空腹血糖的平均值指標(biāo)之間做相關(guān)性分析，生成公式和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 老年小鼠的白色脂肪含量增加，空腹血糖升高，糖耐量減退 隨著年齡的增加，小鼠體重也增加，20周齡及40周齡小鼠的體重均明顯大于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。小鼠附睪脂肪白色脂肪重量/體重的比值隨著年齡的增長(zhǎng)而增大，40周齡組小鼠明顯高于6周齡組(P<0.01)，見(jiàn)圖1B。40周齡組小鼠的空腹血糖明顯高于6周齡組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖1C。在葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射葡萄糖后的30min，各組小鼠的血糖水平均出現(xiàn)高峰，隨后逐漸下降；但在注射后30min和60min，40周齡組小鼠的血糖水平均明顯高于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖1D。40周齡組的糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積明顯大于20周及6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖1E。在附睪、皮下、腹股溝和腸系膜組織中，40周齡組的Slc2a4基因表達(dá)量均明顯少于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖1F。在腹股溝和腸系膜脂肪中，20周齡組的表達(dá)也明顯少于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖1F。隨著小鼠年齡的增大，肝臟、腓腸肌中Slc2a4的基因表達(dá)也呈下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1F。

2.2 老年小鼠的棕色脂肪出現(xiàn)形態(tài)和產(chǎn)熱功能退化 小鼠肩胛間區(qū)的棕色脂肪HE染色結(jié)果顯示，棕色脂肪細(xì)胞直徑逐漸增大，40周齡組小鼠的棕色脂肪失去典型的多泡狀脂滴，脂滴融合成單個(gè)，形態(tài)上與白色脂肪細(xì)胞接近，但細(xì)胞直徑小，見(jiàn)圖2A。棕色脂肪的三種重要的標(biāo)志物Ucp1、Prdm16和Cidea在40周齡組均顯示明顯減少(P<0.05)，20周齡組小鼠的Prdm16的表達(dá)也明顯少于6周齡組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。背部棕色脂肪Ucp1的蛋白表達(dá)量為逐漸下降趨勢(shì)，其中40周齡小鼠的Ucp1蛋白表達(dá)下降了一半以上，減少最為明顯，見(jiàn)圖2C。小鼠冷暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷暴露前，三組小鼠的體溫并無(wú)明顯差別，但40周齡組小鼠在冷暴露第1h后體溫出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，隨著冷暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體內(nèi)發(fā)生適應(yīng)性產(chǎn)熱以維持體溫，體溫有所回升。在第4h，40周齡組小鼠的體溫也明顯低于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖2D。冷暴露過(guò)程中未觀察到小鼠明顯的骨骼肌震顫或體力活動(dòng)的差別。

2.3 老年小鼠米色脂肪細(xì)胞分化減少 小鼠附睪、皮下、腹股溝和腸系膜部位脂肪組織的HE染色顯示，隨著小鼠年齡增大，附睪白色脂肪細(xì)胞直徑逐漸增大，見(jiàn)圖3。在背部皮下脂肪和腹股溝區(qū)脂肪，6周齡和20周齡小鼠的切片上均觀察到多泡狀脂滴的米色脂肪。但在40周齡小鼠切片上只觀察到單泡狀脂肪細(xì)胞的存在。而腸系膜脂肪在6周齡組可以觀察到米色脂肪，但在20周齡和40周齡組均未觀察到明顯的米色脂肪，見(jiàn)圖3。

2.4 各部位脂肪組織中的米色脂肪標(biāo)志物表達(dá)下調(diào) Realtime qPCR結(jié)果顯示， 40周齡組小鼠的皮下和腹股溝脂肪中Ucp1的表達(dá)均明顯下降(P<0.05)；20周齡組小鼠皮下脂肪中Ucp1的表達(dá)也有明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。40周齡組小鼠皮下脂肪Prdm16的表達(dá)明顯少于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖4B。40周齡組小鼠皮下脂肪的Cidea的表達(dá)明顯少于6周齡組(P<0.05)，見(jiàn)圖4C。40周齡組小鼠CD137在腹股溝及腸系膜脂肪均出現(xiàn)明顯表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4D。40周齡小鼠在皮下、腹股溝及腸系膜脂肪均出現(xiàn)Cytc的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，20周齡組小鼠在皮下和腹股溝區(qū)域也出現(xiàn)Cytc的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4E。

圖1老年小鼠的白色脂肪含量增加，空腹血糖升高，糖耐量減退
Figure1Theincreasedwhitefatandfastingbloodglucose,andimpairedglucosetoleranceinagedmice

注：A.6w，20w，40w小鼠的體重(n=6)；B.小鼠附睪白色脂肪/體重(n=6)；C.空腹血糖(n=3)；D.葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(n=3)； E.糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積；F.肝臟、腓腸肌、附睪脂肪、皮下脂肪、腹股溝脂肪及腸系膜脂肪Slc2a4的相對(duì)表達(dá)量(n=3)；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

圖2 老年小鼠的棕色脂肪出現(xiàn)形態(tài)和產(chǎn)熱功能退化Figure 2 Morphological and thermogenic functional deterioration in brown adipose tissue in aged mice

注：A.6，20，40周齡小鼠的肩胛間區(qū)棕色脂肪組織HE染色照片(×400)；B.3組小鼠背部棕色脂肪的Ucp1，Prdm16和Cidea的mRNA相對(duì)表達(dá)量(n=3)；C. Western blot法檢測(cè)三組小鼠背部棕色脂肪Ucp1的蛋白表達(dá)量(n=3)；D.急性冷暴露后小鼠的體溫曲線(n=3)；*P<0.05，**P<0.01

2.5 隨著小鼠年齡增加，Ucp1的表達(dá)量與空腹血糖水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 隨著年齡增長(zhǎng)，小鼠背部棕色脂肪中Ucp1的相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)(R2=0.974)，見(jiàn)圖5A。皮下脂肪組織中Ucp1的相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)(R2=0.8933)，見(jiàn)圖5B。腹股溝脂肪組織中Ucp1的相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖也呈負(fù)相關(guān)(R2=0.7109)，見(jiàn)圖5C。

3 討論

我國(guó)的老年人群中2型糖尿病及糖耐量減退的發(fā)生率居高不下，其中大多數(shù)患者伴有不同程度的肥胖[4]。肥胖主要表現(xiàn)為體內(nèi)白色脂肪含量增多[3]，研究脂肪細(xì)胞分化的分子調(diào)控機(jī)制及肥胖與糖耐量減退的因果關(guān)系，可以幫助尋找治療肥胖癥、糖耐量減退和2型糖尿病的新方法。為了研究年齡相關(guān)的糖耐量減退和2型糖尿病的發(fā)病與脂肪細(xì)胞分化及功能的關(guān)系，我們進(jìn)行了前述一系列研究。結(jié)果表明，老年小鼠棕色脂肪形態(tài)和功能退化及米色脂肪細(xì)胞的分化減少，與其糖耐量減退密切相關(guān)。

人類和小鼠的脂肪組織包括白色脂肪(White adipose tissue，WAT)、經(jīng)典的棕色脂肪[5](Brown adipose tissue，BAT)及米色脂肪(brite/beige adipose tissue)[6]。成熟的白色脂肪細(xì)胞含有單個(gè)大脂滴，胞漿少，細(xì)胞核被擠向一側(cè)，有較少的線粒體，其主要功能是以甘油三酯的形式儲(chǔ)存體內(nèi)多余的能量，但同時(shí)也是重要的內(nèi)分泌器官，可以分泌瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等多種因子[7-8]。白色脂肪按照分布部位又可分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪，通常認(rèn)為內(nèi)臟脂肪的累積是糖耐量減退、2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9-10]。

棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)含有多個(gè)小脂滴，外觀呈多泡狀，胞漿內(nèi)富含線粒體。棕色脂肪線粒體內(nèi)有解偶聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1，Ucp1)，分布在線粒體的內(nèi)膜，可以消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差，利用質(zhì)子濃度差驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化過(guò)程解偶聯(lián)，阻礙了三磷酸腺苷的正常合成，能量以熱的形式散發(fā)出來(lái)[11]。哺乳動(dòng)物的這種產(chǎn)熱方式稱為非顫栗產(chǎn)熱，是哺乳動(dòng)物維持體溫的重要方式。棕色脂肪的能量來(lái)源主要是甘油三酯，另外也可以利用葡萄糖作為原料進(jìn)行產(chǎn)熱活動(dòng)[12-13]。嚙齒動(dòng)物的棕色脂肪終生存在。以往認(rèn)為人類的棕色脂肪主要位于新生兒的肩胛間區(qū)，隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸退化消失。近年來(lái)人們利用PET-CT技術(shù)在成年人的鎖骨、胸腔縱膈、脊柱旁等區(qū)域也發(fā)現(xiàn)棕色脂肪的存在[6]。

圖4 各部位脂肪組織中的米色脂肪標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)Figure 4 The expression of beige fat markers were downregulated in all parts of adipose tissues

注：A-E為各組小鼠不同部位脂肪中的Ucp1、Prdm16、Cidea、CD137、Cytc的基因相對(duì)表達(dá)量；*P<0.05；**P<0.01

圖5 隨著小鼠年齡增加，Ucp1的表達(dá)量與空腹血糖水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系Figure 5 As mice age increases, Ucp1 expression was negatively correlated with fasting blood glucose level

注：A.小鼠棕色脂肪中Ucp1的相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖的相關(guān)分析；B-C為皮下和腹股溝脂肪中Ucp1的相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖的相關(guān)分析

此外，研究者們?cè)谛∈蠛腿祟惖陌咨窘M織中發(fā)現(xiàn)了“米色脂肪細(xì)胞”(beige/brite adipocyte)[14-15]。其形態(tài)上類似棕色脂肪，富含多泡狀脂滴和線粒體，并可表達(dá)Ucp1[6]，功能上也有相似之處，可以利用Ucp1的解偶聯(lián)作用進(jìn)行產(chǎn)熱，這種現(xiàn)象也被成為白色脂肪“棕色化”。棕色和米色兩類脂肪細(xì)胞有類似的形態(tài)和標(biāo)志物，但有不同的細(xì)胞起源。研究發(fā)現(xiàn)，棕色脂肪和米色脂肪均起源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞，但來(lái)源于不同的祖細(xì)胞，棕色脂肪由Myf5+的祖細(xì)胞分化而來(lái)，與骨骼肌細(xì)胞同源；白色和米色脂肪主要由Myf5-的祖細(xì)胞分化而來(lái)[16]。棕色和米色脂肪均可通過(guò)產(chǎn)熱消耗能量，目前已經(jīng)成為肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥研究和治療的新靶點(diǎn)[6, 17-18]。

本實(shí)驗(yàn)選擇不同年齡段的小鼠模擬人類的不同年齡階段進(jìn)行研究。我們分別測(cè)定了三個(gè)不同年齡組小鼠的體重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增加，體重呈逐漸增加趨勢(shì)。小鼠的附睪脂肪墊主要由白色脂肪組成，其與體重之比值逐漸升高，表明小鼠體內(nèi)白色脂肪含量隨著年齡的增加而積累。接著我們測(cè)定了小鼠的空腹血糖以及葡萄糖耐受情況。結(jié)果表明，隨著年齡的增加，小鼠的空腹血糖水平逐漸增高。腹腔注射葡萄糖后，老年小鼠葡萄糖不耐受的情況較中青年小鼠嚴(yán)重。肝臟、骨骼肌和脂肪組織是在糖代謝中發(fā)揮重要作用的三種器官或組織。為觀察各臟器在老年小鼠糖耐量減退中的作用，我們分析了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4，小鼠為Slc2a4)[19]的基因表達(dá)，結(jié)果顯示脂肪組織葡萄糖的攝取能力下降可能在老年小鼠糖耐量減退中發(fā)揮主要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，不論是嚙齒動(dòng)物[20]還是人類[21]，年齡越大，胰島素抵抗/糖耐量減退的發(fā)生率越高。棕色脂肪作為重要的通過(guò)產(chǎn)熱來(lái)消耗能量的器官，內(nèi)含豐富的線粒體和泡沫狀小脂滴。線粒體首先消耗儲(chǔ)存在脂滴內(nèi)的甘油三酯，隨后動(dòng)用血糖和白色脂肪細(xì)胞中的甘油三酯[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，棕色脂肪逐漸出現(xiàn)脂滴增大的現(xiàn)象。棕色脂肪的多泡狀脂滴，有利于增加脂滴膜總表面積，增加脂滴與線粒體的接觸機(jī)會(huì)，便于產(chǎn)熱。若脂滴融合為單個(gè)，將大大減少脂滴膜總表面積，減少線粒體的接觸機(jī)會(huì)，不利于產(chǎn)熱反應(yīng)進(jìn)行[22]。此外，產(chǎn)熱過(guò)程有賴于線粒體內(nèi)膜的Ucp1來(lái)降低氧化過(guò)程中形成的質(zhì)子梯度，解偶聯(lián)氧化-磷酸化過(guò)程，使得ATP合成中斷，能量以熱的形式釋放出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)棕色脂肪中Ucp1的表達(dá)明顯減少，這與前述脂滴融合共同影響產(chǎn)熱效率。棕色脂肪通過(guò)產(chǎn)熱消耗能量，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，產(chǎn)熱能力的下降，可以部分解釋老年小鼠體內(nèi)白色脂肪積累、冷耐受能力下降和糖耐量減退的原因。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增大，形態(tài)學(xué)上米色脂肪逐漸減少，這種減少在20周齡時(shí)已顯現(xiàn)，尤其是在腸系膜脂肪。在40周齡時(shí)各部位米色脂肪細(xì)胞已經(jīng)消失殆盡。各部位的脂肪組織中Ucp1、Prdm16、Cidea等白色脂肪 “棕色化”標(biāo)志物、米色脂肪獨(dú)有的標(biāo)志物CD137[23]及線粒體標(biāo)志物細(xì)胞色素C(Cytc)的表達(dá)均下調(diào)。米色脂肪細(xì)胞的分化減少可使產(chǎn)熱功能受損，消耗甘油三酯/葡萄糖的能力下降。我們對(duì)小鼠棕色脂肪和米色脂肪中Ucp1的基因表達(dá)量與小鼠的空腹血糖值之間進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果顯示，Ucp1的基因表達(dá)與血糖水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。老年小鼠體內(nèi)米色脂肪分化減少導(dǎo)致的耗能減少是小鼠白色脂肪積累，冷耐受能力下降和糖耐量減退的另一重要原因。

4 結(jié)論與展望

老年小鼠棕色脂肪形態(tài)和功能減退以及米色脂肪細(xì)胞分化減少與其糖耐量減退密切相關(guān)。在未來(lái)的研究中，開展針對(duì)人體的上述機(jī)制研究，對(duì)明確老年人糖耐量減退、以及2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理可能具有重要意義。另外，使用具有米色脂肪誘導(dǎo)作用的藥物，如羅格列酮，增加體內(nèi)的米色脂肪含量，可能對(duì)肥胖的老年2型糖尿病患者有更好的效果。