喬菊香 楊紅玉 吳 嘉 彭 湞 沈 放 周麗娟 王云月

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.昆明學院生命科學與技術(shù)系，云南 昆明 650214)

以茉莉酸 (JA)、茉莉酸甲酯 (MeJA) 和茉莉酸異亮氨酸 (JA-Ile) 為代表的茉莉酸類化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的植物激素和信號化合物[1-2]。茉莉酸類化合物在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和參與植物對生物及非生物脅迫的抗性反應過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。茉莉酸的合成起始于亞麻酸，在隨后的JA信號轉(zhuǎn)導反應中，JA通過與L-異亮氨酸結(jié)合而被激活，此反應由JAR1 (JasmonateResistant1) 基因編碼的JA氨基合成酶催化[5]。JAR1基因發(fā)生突變導致JA信號級聯(lián)傳遞受阻。經(jīng)甲基磺酸乙酯 (EMS) 誘變的jar1-1擬南芥突變體出現(xiàn)雄性育性受損，對真菌病原物、害蟲和臭氧等脅迫的抗性下降[6-9 ]。在了解茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑所調(diào)控的生物學反應機制研究中，jar1 (jasmonate-insensitivemutant1)突變體是一個重要的實驗材料。T-DNA插入導致基因失活，整合的拷貝數(shù)較低，能夠穩(wěn)定遺傳給后代，適于反向遺傳學分析。本研究從擬南芥生物資源中心 (ABRC) 購買了JAR1 (At2g46370) 的T-DNA 插入突變體jar1(SALK_030821)。利用 “三引物” PCR方法，鑒定了此材料的突變位點及其純合性。通過qRT-PCR，測定了純合突變體jar1中JAR1基因的表達量，并通過茉莉酸敏感性試驗加以驗證。本研究結(jié)果為進一步了解茉莉酸信號途徑的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生型擬南芥 (Arabidopsisthaliana) 為Columbia (Col-0) 生態(tài)型。At2g46370的T-DNA插入突變體jar1 (SALK_030821) 的種子購買自擬南芥生物資源中心。

1.2 供試材料培養(yǎng)

種子用5%的次氯酸鈉消毒5～10 min，無菌水沖洗3～5次，點播在MS固體培養(yǎng)基上，parafilm膜封口，置于4 ℃冰箱中低溫春化2～3 d。移至光照12 h/d、22 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后將幼苗移栽到裝有V(營養(yǎng)土)∶V(蛭石) 為2∶1的小盆中培養(yǎng)，用透明的塑料薄膜封口后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，2～3 d后揭開薄膜。用于茉莉酸甲酯敏感性實驗的擬南芥種子播于含有28 μmol/L茉莉酸甲酯的MS培養(yǎng)基上進行垂直培養(yǎng)，觀察根的生長情況。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件：光照強度約50 μmol/(m2·s)，光照12 h/d，相對濕度60%～70%，溫度22～23 ℃。

1.3 基因組 DNA提取

本實驗基因組DNA提取使用Edwards法[10]提取。從擬南芥植株上取1～2片新鮮的葉片置于1.5 mL滅菌離心管中研磨成勻漿；加入400 μL的Edwards提取液繼續(xù)研磨，混勻后常溫12 000 r/min離心5 min；上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL滅菌離心管中，加入500 μL異丙醇混勻，-20 ℃放置5～10 min；室溫12 000 r/min離心5 min；棄上清，沉淀用70%的乙醇洗1次；棄上清，室溫干燥10～15 min；溶于20～50 μL的滅菌水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 純合突變體的鑒定

以所提取植株的基因組DNA為模板，參照李敏等[11]的方法，進行 “三引物法” 的PCR擴增。PCR所用引物出自SIGnAL (http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)。SALK_030821的鑒定引物為：LP：5′-CTCGGAAATTCAAATGGATCC-3′ RP：5′-TAGAATCGGCTGCAAAGAGAC-3′；T-DNA左邊界引物為LBa1：5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3′。引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。

1.5 熒光實時定量RT-PCR

利用TRIzol法提取總RNA，用分光光度計 (BioDrop) 進行濃度和OD260/OD280，OD260/OD230的測定，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa) 說明書方法去除RNA樣品中所含的基因組DNA以及cDNA鏈的合成。使用熒光定量儀eppedorf Mastercycler?ep realplex和熒光定量試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)進行熒光定量qRT-PCR檢測。以ACTIN2基因作為內(nèi)參，每個樣品做3次重復。JAR1基因的引物序列為：5′-CGATGTCTCGACAGATCC-3′和5′-CTCGGTCTAAACAGT-TGCAG-3′；ACTIN2的引物序列為：5′-ACCGTTT-CGCTTTCCTTAGTGTTAGCT-3′和5′-AGCGAACGGATCTAGAGACTCACCTTG-3′。引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-DNA插入位點及其純合性鑒定

擬南芥JAR1基因的T-DNA插入突變體jar1 (SALK_030821) 為正向插入突變體，插入位點位于第5個外顯子上 (圖1)。使用JAR1正向引物 (LP) 及反向引物 (RP) (圖1)，分別以jar1突變體和野生型植株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，預期條帶為1 056 bp。結(jié)果顯示只有野生型植物出現(xiàn)預期的PCR產(chǎn)物 (圖2)。

用T-DNA的左邊界引物LBa1與JAR1基因反向引物RP配對，以jar1突變體和野生型植物的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，預期的產(chǎn)物為529～829 bp。結(jié)果表明，jar1突變體出現(xiàn)預期的DNA條帶，而野生型中沒有相應的DNA條帶 (圖2)。說明1～7號植株基因組中T-DNA插入的位點正確，且均為T-DNA插入的純合突變體。將鑒定出的純合突變體單株收種，擴繁保存。

LP.T-DNA插入突變的左端引物；RP.T-DNA插入突變的右端引物；LBa1.載體特異性引物。

圖1JAR1基因結(jié)構(gòu)、突變及其驗證引物示意
Fig.1 Sketch ofJAR1 gene structure,mutant position and its validation PCR primers

LP.T-DNA插入突變的左端引物；RP.T-DNA插入突變的右端引物；LBa1.載體特異性引物。

圖2jar1突變體PCR鑒定
Fig.2 PCR detection ofjar1 mutants

2.2 純合突變體中JAR1基因表達量分析

利用熒光實時定量qRT-PCR技術(shù)，對jar1純合突變體植株中JAR1基因的表達量進行分析。發(fā)現(xiàn)jar1中JAR1基因的表達量降低至野生型植株的41.2% (圖3)，結(jié)果表明，T-DNA的插入導致jar1純合突變體中JAR1基因的表達量顯著下降 (P< 0.05)。

小寫字母不同表示差異顯著。

圖3野生型和jar1突變體中JAR1基因的表達量
Fig.3 Expression ofJAR1 gene in wild type andjar1 mutant plants

2.3 突變體對茉莉酸的敏感性實驗

野生型與jar1根對茉莉酸甲酯的感受性檢測見圖4。

大寫字母不同表示差異極顯著。

a.野生型幼苗在不含MeJA的MS培養(yǎng)基上的根生長情況；

b.野生型幼苗在含28 μmol/L MeJA的MS培養(yǎng)基上的根生長情況；

c.jar1幼苗在不含MeJA的MS培養(yǎng)基上的根生長情況；

d.jar1幼苗在含28 μmol/L MeJA的MS培養(yǎng)基上的根生長情況；

e.野生型與jar1突變體根生長長度。

圖4野生型與jar1根對茉莉酸甲酯的感受性檢測
Fig.4 Response of wild type andjar1 seedling to MeJA treatment

JAR1蛋白在植物防御生物和非生物脅迫反應過程中發(fā)揮著重要作用。JAR1基因突變后，擬南芥植株對茉莉酸的感受性降低。利用茉莉酸甲酯會抑制擬南芥根的正常生長特性[12]，將擬南芥種子點播在含有MeJA的MS培養(yǎng)基上，以點播在不含MeJA的MS培養(yǎng)基上為對照。通過垂直培養(yǎng)，觀察幼苗根的生長情況，以了解突變體對茉莉酸的響應變化。將jar1的純合突變體和野生型種子經(jīng)消毒后點播于含有28 μmol/L茉莉酸甲酯的MS培養(yǎng)基上，在組培室垂直培養(yǎng)20 d，發(fā)現(xiàn)野生型幼苗生長受到嚴重抑制，而jar1突變體幼苗的生長受抑制程度顯著低于野生型的，即其根長明顯長于野生型 (圖4)。結(jié)果表明，JAR1基因表達量的下調(diào)導致jar1純合突變體對茉莉酸甲酯的敏感性降低。

3 結(jié)論與討論

通過實驗，鑒定得到了擬南芥JAR1基因的T-DNA插入純合突變體jar1。通過對其插入位點進行分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA位于第5個外顯子上。qRT-PCR以及茉莉酸感受性結(jié)果分析顯示，純合突變體jar1中JAR1基因的表達量降低為野生型植株的41.2%，并且突變體幼苗對茉莉酸的敏感性顯著降低。

茉莉酸類化合物作為植物激素及信號分子涉及多種關(guān)鍵的功能，包括對病原體和昆蟲的防御、防止臭氧和澇害等的損害，以及調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育等。JAR1基因影響茉莉酸類化合物的合成，并且其作為一個信號中間體，參與茉莉酸信號途徑的調(diào)控[5]。實驗中獲得的擬南芥JAR1基因的突變體對MeJA的敏感性降低，表明其影響茉莉酸信號的轉(zhuǎn)導。

研究發(fā)現(xiàn)，在根生長抑制測定中，JAR1基因的一些EMS誘變突變體，如jar1-1，jar1-8和jar1-11對MeJA表現(xiàn)出中等敏感性[13]。Staswick等[14]在研究突變體jar1對外源MeJA敏感性時發(fā)現(xiàn)，野生型植株在含有100 μmol/L的MeJA的培養(yǎng)基中生長9 d，根的生長受到強烈抑制，然而，同樣條件下jar1突變體根的受抑制程度顯著降低，說明對MeJA具有抗性。此外，在沒有MeJA的情況下，突變體幼苗根的生長與野生型相當。本實驗發(fā)現(xiàn)在不存在外源茉莉酸的情況下，jar1根的發(fā)育沒有受到明顯影響。當在MS培養(yǎng)基中加入28 μmol/L的MeJA后，其根伸長受到抑制，但與同樣生長在MeJA培養(yǎng)基中的野生型相比較，jar1的根長顯著長于野生型，此結(jié)果與Staswick等人的研究結(jié)果一致。表明JAR1不直接參與正常的根生長，但是影響對外源MeJA的敏感性。

大量的研究結(jié)果顯示，插入位點位于外顯子上的T-DNA插入突變體會導致目的基因表達量的下降。李琳琳等在研究擬南芥干旱敏感突變體時，通過分析擬南芥AT2G06025基因的T-DNA插入突變體發(fā)現(xiàn)，其插入位點位于第7個外顯子上，并且在突變體中基因的表達量明顯低于野生型[15]。李斯琪等通過分析擬南芥DUF647蛋白家族成員AT2G23470的T-DNA插入突變體發(fā)現(xiàn)，其獲得的位于第2個外顯子上的T-DNA插入突變體為基因表達完全缺失突變體[16]。本研究的植物材料jar1突變體的T-DNA插入位點位于第5個外顯子上，影響了該基因的正常轉(zhuǎn)錄，導致JAR1基因的表達顯著下調(diào)，最終可能導致部分翻譯提前終止，從而使突變體幼苗對茉莉酸甲酯的感受性顯著降低。該jar1可作為信號轉(zhuǎn)導突變體用于茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑的分析。