吳小英，安婷婷，高炳淼

1海南省人民醫(yī)院；2海南省藥物研究所，?？?570311；3海南醫(yī)學(xué)院，?？?571199

芋螺(Cone Snail)主要生長(zhǎng)于熱帶海域，屬于軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，芋螺科，是在沿海珊瑚礁、沙灘上生活的美麗的螺類[1]。芋螺毒素(conotoxins)是來(lái)源于芋螺毒管中用于捕獵的一類多肽的集合，其具有豐度高、分子量小、結(jié)構(gòu)多樣、靶點(diǎn)廣泛、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為國(guó)內(nèi)外極受關(guān)注的新興研究熱點(diǎn)[2,3]。全世界約有500種以上芋螺，根據(jù)芋螺食性可分為三大類：食蟲(chóng)芋螺(大于350種)，食螺芋螺(約70種)，食魚(yú)芋螺(約70種)[4,5]。我國(guó)芋螺約有80余種，主要分布在海南省管轄的西沙群島、南沙群島和中沙群島，以及臺(tái)灣島等熱帶海區(qū)[6]。至今，已從數(shù)百種芋螺中分離到了上千種芋螺毒素，其在鎮(zhèn)痛、癲癇治療、癌癥、戒煙戒毒、疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[7]。部分芋螺毒素已進(jìn)入臨床研究或已被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥[8]。如由Olivera等從幻芋螺(Conus magus)中分離的ω-MVIIA，已被美國(guó)FAD正式批準(zhǔn)為治療頑痛的藥物，其商品名為Ziconotide[9]。

隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的普遍使用，農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的耐藥性不斷增加，導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑毒性和使用量都越來(lái)越大，生態(tài)環(huán)境受到巨大傷害，進(jìn)而嚴(yán)重威脅著人類健康，由此對(duì)新型、高效、安全生物殺蟲(chóng)劑的需求非常迫切[10,11]。食蟲(chóng)芋螺毒素能夠特異性作用于昆蟲(chóng)而具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)能力，對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性很小或無(wú)毒副作用，而食蟲(chóng)芋螺毒素的殺蟲(chóng)活性和作用靶點(diǎn)尚未展開(kāi)系統(tǒng)研究[12]。因此，開(kāi)展食蟲(chóng)芋螺毒素的研究，篩選獲得高效殺蟲(chóng)芋螺毒素，為解決化學(xué)農(nóng)藥造成的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題提供一條新途徑。本研究化學(xué)合成了芋螺毒素線性肽ImI，經(jīng)兩步氧化法后質(zhì)譜鑒定獲得氧化折疊肽ImI，采用MTT法和昆蟲(chóng)注射法測(cè)試其殺蟲(chóng)活性，可為研發(fā)新型、高效、安全生物殺蟲(chóng)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多肽合成相關(guān)氨基酸活化試劑(ABI，美國(guó))；色譜級(jí)三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA )和色譜級(jí)乙腈(Acetonitrile，ACN)，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Vydac分析型C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)及制備型C18柱(10 μm，22 mm×250 mm)，購(gòu)于上海申越實(shí)驗(yàn)器材有限公司。其他常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

多肽合成儀(ABI 433，美國(guó))；高效液相色譜儀(Waters2535，美國(guó))；電噴霧電離質(zhì)譜(島津，日本)；冷凍干燥機(jī)(Christ，德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 線性肽的合成

芋螺毒素ImI線性肽(GCCSDPRCAWRC-NH2)的合成參照文獻(xiàn)[12]的方法，采用Fmoc化學(xué)方法合成ImI的線性肽，樹(shù)脂為Wang Resin，從C端至N端合成，HBTU/HOBt/DIEA縮合形成肽鍵。合成過(guò)程中非半胱氨酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)如下所示：Ser(tBu)，Asp(OtBu)，Arg(Pbf)，Trp(Boc)。半胱氨酸Cys 1和Cys 3用S-Trityl(Trt)保護(hù)基團(tuán)，Cys 2和Cys 4用S-acetamidomethyl(Acm)保護(hù)基團(tuán)。樹(shù)脂肽合成后，按照每20 mg的樹(shù)脂肽1mL試劑K(82.5% TFA/5% phenol/5% H2O/5% Thioanisole/2.5% EDT，v/v)切割(室溫2 h)，過(guò)濾并用20倍體積的-20 ℃冰乙醚沉淀和洗滌回收線性肽粗品，進(jìn)行HPLC純化，采用Vydac C18柱：流動(dòng)相A(水，0.1%TFA)，流動(dòng)相B(乙腈，0.1%TFA)；流速12 mL/min；60 min線性梯度洗脫，B相20%至80%，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。經(jīng)過(guò)HPLC反復(fù)純化后獲得線性肽，分析型HPLC分析其純度達(dá)95%以上，通過(guò)質(zhì)譜鑒定無(wú)誤后，進(jìn)行凍干保存，用于后續(xù)的氧化折疊反應(yīng)。

1.3.2 兩步法氧化折疊

第一步氧化，將純化后線性肽溶于鐵氰化鉀反應(yīng)液(K3[Fe(CN)6]10 mmol/L，Tris 0.1 mol/L，pH 7.5)中促使形成第一對(duì)二硫鍵(Cys1和Cys3)，線性肽濃度不高于50 mg/mL，室溫氧化折疊45 min。HPLC純化反應(yīng)后的產(chǎn)物，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。第二步氧化，將純化的產(chǎn)物加入充入氮?dú)獗Ｗo(hù)的碘(I2)反應(yīng)液中(7.5 mmol/L I2溶液;水/TFA/乙腈=73∶3∶24，V/V)，反應(yīng)5～10 min，加抗壞血酸至溶液顏色消失，形成第二對(duì)二硫鍵(Cys2和Cys4)得到ImI最終活性產(chǎn)物。采用HPLC對(duì)合成的產(chǎn)物純化并進(jìn)行質(zhì)譜確認(rèn)。

1.3.3 MTT法

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔100 μL接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量控制在103個(gè)左右，27 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的芋螺毒素純品，每組各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以不加抑制劑的實(shí)驗(yàn)組作對(duì)照。27 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入濃度為5 mg /mL的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去板中培養(yǎng)液及MTT，每孔加入100 μL DMSO(二甲基亞砜)，室溫低速震蕩15 min。待結(jié)晶物完全溶解后，在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀測(cè)定490 nm處的吸光度值。

1.3.4 昆蟲(chóng)注射法

選用3齡或4齡的黃粉蟲(chóng)(約180 mg/條)，注射前采用雞飼料正常喂食。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將芋螺毒素溶解在0.7%鹽水中至所需濃度，使用微注射器(氣相尖頭微量進(jìn)樣器，10 μL，上海高鴿)進(jìn)行注射，注射體積為5 μL，用10 μL 0.7%鹽水沖洗導(dǎo)管死腔中殘留藥物。將溶解的芋螺毒素分別以不同濃度注射到黃粉蟲(chóng)體內(nèi)(n=10)。用0.7%鹽水溶液注射對(duì)照組黃粉蟲(chóng)(n=10)，每個(gè)濃度做三次重復(fù)。在48小時(shí)觀察注射芋螺毒素或0.7%鹽水的黃粉蟲(chóng)死亡情況。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism6，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，兩組間數(shù)據(jù)分析比較采用t檢驗(yàn)。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 線性肽的合成

采用化學(xué)方法合成了ImI線性肽，對(duì)粗肽進(jìn)行HPLC純化(見(jiàn)圖 1)。ImI線性肽的洗脫時(shí)間為 9.653 min，最終得到純度為95%的線性肽約20.2 mg。

圖1 HPLC純化線性肽ImIFig.1 HPLC Purification of linear peptide ImI

2.2 氧化折疊

利用鐵氰化鉀溶液和I2溶液對(duì)合成的線性肽ImI進(jìn)行兩步法氧化折疊，并對(duì)氧化折疊終產(chǎn)物進(jìn)行HPLC純化和質(zhì)譜鑒定。樹(shù)脂切割后的線性肽分子量為1497.78 Da，符合含有Acm保護(hù)基團(tuán)的ImI分子量。經(jīng)第一步氧化后的分子量為1495.78 Da，與氧化前相比少了2 Da，證明第一對(duì)二硫鍵形成。第二步氧化折疊后質(zhì)譜鑒定ImI分子量為1351.58 Da，與第一步氧化后的分子量相差144.2 Da，證明第二步氧化折疊是切割兩個(gè)Acm保護(hù)基團(tuán)并形成了第二對(duì)二硫鍵(如圖2)。再與其線性肽的分子量1355.634 Da 相差約4 Da，亦證明脫去4個(gè)氫原子形成了兩對(duì)二硫鍵。通過(guò)兩步氧化法最終從20.2 mg線性肽ImI中獲得活性產(chǎn)物約9.75 mg，產(chǎn)率為48.3%。

圖2 氧化折疊后ImI的質(zhì)譜鑒定Fig.2 Identification of oxidative folding ImI by mass spectrometry

2.3 MTT法

通過(guò)MTT法測(cè)試芋螺毒素ImI對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，與對(duì)照組(0.7% NaCl溶液)相比，實(shí)驗(yàn)組均具有顯著性差異。芋螺毒素ImI對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9的抑制效果具有劑量效應(yīng)，半數(shù)有效量為 0.13 nM。

2.4 昆蟲(chóng)注射法

不同濃度的芋螺毒素ImI被注射到黃粉蟲(chóng)的腹部來(lái)評(píng)價(jià)其殺蟲(chóng)作用。圖4可以看出空白對(duì)照和陰性對(duì)照組致死率均為0，表明注射法模型對(duì)于評(píng)價(jià)殺蟲(chóng)作用是可行的。隨著芋螺毒素ImI的注射量的增加，對(duì)昆蟲(chóng)的致死率從16.6%到66.7%，經(jīng)計(jì)算黃粉蟲(chóng)的半數(shù)致死劑量為0.11 μg/mg。

圖3 芋螺毒素ImI對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of conotoxin ImI on growth of insect sf9 cells注：測(cè)試組對(duì)比于陰性對(duì)照組，*表示具有顯著性差異(*P < 0.05,**P < 0.01)。Note:Compared with the negative control group,the test group showed significant difference(*P < 0.05,**P < 0.01).

圖4 芋螺毒素ImI對(duì)黃粉蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用Fig.4 Insecticidal effects of conotoxin ImI注：測(cè)試組對(duì)比于陰性對(duì)照組，*表示具有顯著性差異(** P < 0.01,***P< 0.001,**** P <0.0001)。Note:the test group was compared with the negative control group and * indicated significant difference(**P < 0.01,*** P<0.001,****P< 0.0001).

3 討論

隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的普遍使用，農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的耐藥性不斷增加，導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑毒性和使用量都越來(lái)越大，食品安全和環(huán)境生態(tài)問(wèn)題頻現(xiàn)，進(jìn)而嚴(yán)重威脅著人類健康[13]。雖然采取了禁用高毒農(nóng)藥等措施，但也將出現(xiàn)可替代新農(nóng)藥品種缺乏等諸多問(wèn)題。因此，對(duì)新型、高效、安全的生物殺蟲(chóng)劑的需求非常迫切。

乙酰膽堿受體(nAChR)是脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中快速介導(dǎo)膽堿能突觸傳遞的配基門(mén)控離子通道[14]。在昆蟲(chóng)中，nAChR在神經(jīng)肌肉接頭處沒(méi)有分布，卻是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)遞質(zhì)受體，因此成為殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)[15]。John Moon等采用注射法將重組肽Tgu6.1注射到多毛蟲(chóng)中樞神經(jīng)索部位，來(lái)鑒定殺蟲(chóng)活性[16]。Monica Mejia等[17]開(kāi)發(fā)一種使用果蠅注射和電生理記錄的篩選芋螺毒素的新方法。芋螺毒素ImI是來(lái)源于食蟲(chóng)帝王芋螺(Conusimperialis)，具有4個(gè)半胱氨酸形成2個(gè)二硫鍵，其作用靶點(diǎn)為α7-nAChR，我們推測(cè)其具有殺蟲(chóng)活性[18,19]。采用化學(xué)方法合成芋螺毒素線性肽，經(jīng)氧化折疊后質(zhì)譜鑒定獲得芋螺毒素ImI，采用MTT法和昆蟲(chóng)注射法研究其殺蟲(chóng)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芋螺毒素ImI具有抑制昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9生長(zhǎng)的活性，半數(shù)有效量為0.13 nM；對(duì)黃粉蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性，半數(shù)致死劑量為0.11 μg/mg。

目前認(rèn)為多肽類毒素發(fā)揮殺蟲(chóng)作用的第一作用靶標(biāo)為nAChR，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其具體作用位點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)果蠅、桃蚜、煙草天蛾等昆蟲(chóng)的nAChR進(jìn)行了分子克隆和功能鑒定，為殺蟲(chóng)劑作用機(jī)理及抗性機(jī)制的研究提供分子基礎(chǔ)[20]。多肽類毒素類殺蟲(chóng)劑作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)傳導(dǎo)的突觸部位，與乙酰膽堿競(jìng)爭(zhēng)受體位點(diǎn)，占領(lǐng)受體位點(diǎn)后，抑制神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)，造成昆蟲(chóng)麻痹，最終死亡[21]。因此，以nAChR作為靶標(biāo)來(lái)研發(fā)新型殺蟲(chóng)劑需要加以重視，搞清楚芋螺毒素如何特異性作用于昆蟲(chóng)nAChR各種亞基的作用位點(diǎn)，從本質(zhì)上揭示其殺蟲(chóng)作用機(jī)制，以進(jìn)行殺蟲(chóng)劑的合理設(shè)計(jì)和高通量篩選，創(chuàng)制出新型生物殺蟲(chóng)劑，提高其在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用價(jià)值將是進(jìn)一步需要開(kāi)展的工作。