廖 青，劉永賢，邢 穎，梁潘霞，潘麗萍，陳錦平，江澤普

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土壤富硒細(xì)菌的篩選、鑒定①

廖 青，劉永賢，邢 穎，梁潘霞，潘麗萍，陳錦平，江澤普*

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/廣西富硒農(nóng)業(yè)研究中心，南寧 530007)

從廣西不同富硒區(qū)土壤中分離出32株耐硒細(xì)菌，通過優(yōu)化加硒時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間及加硒濃度進(jìn)行富硒試驗(yàn)，篩選獲得4株富硒能力較強(qiáng)的細(xì)菌，進(jìn)一步通過對4株細(xì)菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析明確了各菌株的種屬關(guān)系。經(jīng)鑒定，YLB1-6為，TXB1-10為，TXB2-5為，GPB1-5為。在最適加硒時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間及適宜加硒濃度條件下，各菌株的硒轉(zhuǎn)化率分別為：YLB1-6 74.22%，TXB1-10 66.05%，TXB2-5 55.31%，GPB1-5 63.30%。各菌株處理能顯著提高土壤可交換態(tài)硒含量，對土壤硒起到較強(qiáng)活化作用。土壤富硒細(xì)菌為硒轉(zhuǎn)化提供更多的高效微生物載體，并為富硒產(chǎn)品開發(fā)研究提供技術(shù)支持。

富硒細(xì)菌；硒轉(zhuǎn)化率；篩選；鑒定

硒是人體必需的一種微量營養(yǎng)元素，對人體有預(yù)防疾病、增強(qiáng)體質(zhì)及延緩衰老等功效[1]。廣西富硒土壤面積達(dá)212萬hm2[2]，土壤硒含量最高可達(dá)2.29 mg/kg[3]，為發(fā)展富硒農(nóng)產(chǎn)品提供了有利的基礎(chǔ)條件。然而，廣西富硒土壤多呈酸性，土壤中的硒易與鐵形成難溶的復(fù)合亞硒酸鐵，從而導(dǎo)致其有效性較低[4]，直接影響了廣西富硒土壤資源的有效利用。研究表明，土壤硒的生物有效性受到環(huán)境微生物的顯著影響[5]，微生物通過自身代謝作用可以實(shí)現(xiàn)硒形態(tài)、價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)化，從而提高土壤硒的生物有效利用率。因此，篩選高效、穩(wěn)定的具有硒代謝轉(zhuǎn)化能力的富硒微生物，是開發(fā)利用土壤硒資源的有效途徑。

對土壤微生物硒耐受性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)硒的耐受性：細(xì)菌>真菌>放線菌[6]，土壤細(xì)菌能在高硒環(huán)境下將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化且生長良好，說明土壤細(xì)菌對硒具有較好的代謝能力。因此，本研究主要側(cè)重于富硒土壤中細(xì)菌的分離，采用含硒培養(yǎng)基篩選耐硒細(xì)菌，進(jìn)一步通過富硒試驗(yàn)獲得硒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的菌株，并對其進(jìn)行鑒定，以期獲得硒高效轉(zhuǎn)化微生物載體，為土壤硒資源利用、富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.3±0.2；固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

亞硒酸鈉(Na2SeO3，AR 98%)購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他化學(xué)藥品均為國內(nèi)生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

硒液制備：稱取22.35 g Na2SeO3，溶于去離子水中并定容至100 ml，此溶液硒濃度為100 mg/ml，使用無菌濾頭(0.22 μm)過濾后備用，存于避光處。使用時(shí)取上述硒液用滅菌去離子水稀釋至20 mg/ml。

1.2 菌株的分離和純化

從廣西多個(gè)富硒區(qū)采集土壤樣品，稱取10 g土樣加入到預(yù)先裝有10顆玻璃珠的90 ml的無菌PBS中，30 ℃、200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，收集土壤懸液，于5 000 r/min離心15 min，沉淀用10 ml PBS懸浮，4 ℃ 保存?zhèn)溆?。? ml制備好的樣品加入到100 ml含硒濃度為100 μg/ml的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)2 d進(jìn)行篩選，然后用梯度稀釋法制備10-2~ 10-6系列稀釋液，取100 μl分別涂布到固體培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)至菌落長好，挑取具有不同菌落形態(tài)特征的單個(gè)菌落，采用平板劃線法進(jìn)行重復(fù)分離純化，獲得菌株純培養(yǎng)物。

1.3 菌株生長曲線測定

從固體培養(yǎng)基上挑取菌株接種于含10 ml 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，活化后按5% 接種量轉(zhuǎn)接于100 ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃ 搖床培養(yǎng)，每隔1 h取樣液，用分光光度計(jì)在530 nm波長下測定吸光度值，繪制菌株的生長曲線。

1.4 適宜硒濃度的測定

按1 μg/ml硒濃度梯度遞增依次制備含硒量為1 ~ 20 μg/ml的液體培養(yǎng)基，待菌株活化后，按5%接種量依次接種于上述含硒液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，根據(jù)菌液顏色變化確定適宜硒質(zhì)量濃度。

1.5 富硒能力測定

菌株活化后按5% 接種量轉(zhuǎn)接于100 ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在菌株適宜硒濃度、適宜加硒時(shí)間及其合適培養(yǎng)時(shí)間條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌懸液4 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)消解反應(yīng)后用原子熒光光度計(jì)測量熒光強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣液的硒濃度，由硒轉(zhuǎn)化率公式獲悉菌株的富硒能力[7]。

硒轉(zhuǎn)化率(%)=(總硒含量-殘留無機(jī)硒含量)/總硒含量×100

1.6 菌株的鑒定

挑選具有較強(qiáng)富硒能力的菌株，用液體培養(yǎng)基活化，提取細(xì)菌基因組總DNA并以其為模板，采用細(xì)菌通用引物(27F/1492R)擴(kuò)增其16S rRNA基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后在ABI3730測序儀上進(jìn)行測序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確菌株的種屬關(guān)系。

1.7 菌株對土壤硒的活化

利用浸提劑提取的土壤化學(xué)有效性可反映土壤硒的生物有效性[8]。菌株土壤硒活化試驗(yàn)方法參照龍?jiān)拼ǖ萚9]的方法進(jìn)行。富硒土壤中的水溶態(tài)硒用超純水浸提，可交換態(tài)硒用0.1 mol/L KH2PO4- K2HPO4溶液浸提[10]。樣品經(jīng)相關(guān)處理后，其硒含量用原子熒光光譜儀測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用 Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐硒細(xì)菌的篩選

本試驗(yàn)從廣西永福(砂頁巖紅壤，全硒0.567 mg/kg)、玉林(砂頁巖赤紅壤，全硒1.804 mg/kg)、桂平(砂頁巖赤紅壤，全硒1.188 mg/kg)、藤縣(砂頁巖赤紅壤，全硒0.580 mg/kg)等多個(gè)富硒區(qū)采集土壤樣品，采用含硒液體培養(yǎng)基進(jìn)行耐硒細(xì)菌篩選，并利用梯度稀釋涂板法分離獲得具有不同菌落特征的細(xì)菌32株。采用平板劃線法將這些菌株進(jìn)行純化，菌株純化后于試管斜面上4 ℃保藏。所獲耐硒細(xì)菌中，6株來源于永福，9株來源于玉林，12株來源于藤縣，5株來源于桂平，表明廣西不同富硒區(qū)中，砂頁巖母質(zhì)紅壤、赤紅壤均有耐硒細(xì)菌存在。

2.2 菌株的生長曲線

由菌株生長曲線可知菌株的對數(shù)生長期及所需培養(yǎng)時(shí)間。對各耐硒菌株進(jìn)行生長曲線測定后發(fā)現(xiàn)，不同耐硒細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間及其持續(xù)時(shí)間、到達(dá)生長穩(wěn)定期所需時(shí)間均存在差異。從生長周期考慮，本研究篩選出4株培養(yǎng)時(shí)間較短的菌株進(jìn)行下一步研究。4株耐硒細(xì)菌分別命名為YLB1-6(玉林)、TXB1-10(藤縣)、TXB2-5(藤縣)和GPB1-5(桂平)，其生長曲線如圖1所示，YLB1-6在1 ~ 4 h時(shí)處于對數(shù)生長期，對數(shù)期出現(xiàn)較早且較短，4 ~ 7 h處在穩(wěn)定期；其他3株細(xì)菌在2 ~ 6 h處于對數(shù)生長期，6 ~ 10 h處于穩(wěn)定期。菌株對數(shù)生長期細(xì)胞生長速率最快，代謝也最為旺盛，這個(gè)時(shí)期加硒有利于硒的轉(zhuǎn)化，但加硒過早會對菌體代謝活動有抑制作用[11]，過晚菌體發(fā)生自溶也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低，因此在對數(shù)生長期的中期加硒轉(zhuǎn)化效果最好。由此確定，YLB1-6最適加硒時(shí)間為第2.5 h，培養(yǎng)時(shí)間為7 h；其他3株細(xì)菌最適加硒時(shí)間為第4 h，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。

圖1 耐硒細(xì)菌生長曲線

2.3 菌株適宜硒濃度的確定

不同硒濃度下，各菌株菌液顏色變化如表1所示。隨著液體培養(yǎng)基中硒濃度的增加，菌液呈不紅→紅色不明顯→紅色變化趨勢。當(dāng)菌液出現(xiàn)紅色時(shí)，說明菌株將Na2SeO3轉(zhuǎn)化為紅色單質(zhì)硒[12]，為了避免過多單質(zhì)硒的產(chǎn)生，提高有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率，選擇菌液呈紅色不明顯時(shí)的硒濃度作為適宜硒濃度，即YLB1-6和TXB2-5為6 μg/ml，TXB1-10為4 μg/ml，GPB1-5為8 μg/ml。

表1 不同硒濃度菌液顏色變化

注：“-”表示菌液沒變紅，“○”表示菌液紅色不明顯，“+”表示菌液呈紅色。

2.4 菌株的富硒能力

在各菌株適宜硒濃度、適宜加硒時(shí)間及其合適培養(yǎng)時(shí)間條件下進(jìn)行菌株富硒試驗(yàn)，由硒轉(zhuǎn)化率公式可知各菌株的富硒能力。經(jīng)富硒試驗(yàn)后，YLB1-6、TXB1-10、TXB2-5和GPB1-5殘留無機(jī)硒含量分別為1.547、1.358、2.681和2.936 μg/ml，菌株硒轉(zhuǎn)化率依次為74.22%、66.05%、55.31% 和63.30%，YLB1-6與TXB1-10、GPB1-5和TXB2-5菌株之間的硒轉(zhuǎn)化率差異均達(dá)極顯著水平，4個(gè)耐硒菌富硒能力由大到小排序?yàn)椋篩LB1-6＞TXB1-10＞GPB1-5＞TXB2-5(表2)。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的富硒細(xì)菌，其硒轉(zhuǎn)化率為50% ~ 80%[7,11-14]。本研究所篩4株富硒細(xì)菌的硒轉(zhuǎn)化率均達(dá)50% 以上，具有較強(qiáng)富硒能力。

表2 富硒細(xì)菌的硒轉(zhuǎn)化率

注：同列數(shù)據(jù)后大小寫字母不同分別表示差異達(dá)到<0.01 和<0.05顯著水平，下表同。

2.5 富硒細(xì)菌的鑒定

通過PCR擴(kuò)增，各富硒細(xì)菌的16S rDNA序列長度均在1 450 bp左右。BLAST分析結(jié)果(表3)表明，這4 株富硒細(xì)菌與其同源菌株相似性均在 99% 以上；進(jìn)一步采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建了富硒細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，經(jīng)鑒定，YLB1-6為，TXB1-10為，TXB2-5為，GPB1-5為。目前文獻(xiàn)報(bào)道的富硒細(xì)菌有、、和[13,15]，而本研究中和具有富硒能力為首次報(bào)道，豐富了富硒菌株的種類。

表3 菌株 16S rDNA 序列同源性分析結(jié)果

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 菌株對土壤硒的活化能力

水溶態(tài)硒和可交換態(tài)硒是土壤有效硒的主要形態(tài)。從表4可以看出，各處理中可交換態(tài)硒為主要的有效硒形態(tài)，而水溶性硒所占有效硒的比例較?。煌寥澜?jīng)各菌株制成的菌劑處理后，各處理水溶態(tài)硒與CK相比無明顯差異，而可交換態(tài)硒均有不同程度的提高。CK可交換態(tài)硒含量為0.053 mg/kg，各菌劑處理的可交換態(tài)硒含量提高至0.085 ~ 0.112 mg/kg，其中YLB1-6和TXB1-10菌劑處理均極顯著提高了土壤可交換態(tài)硒含量(＜0.01)，TXB2-5和GPB1-5菌劑處理也顯著提高了土壤可交換態(tài)硒含量(＜0.05)。本研究中，土壤經(jīng)菌劑處理后，可交換態(tài)硒含量顯著提高，可能是吸附于氧化物和黏土礦物表面的亞硒酸鹽更易與菌株分泌的肽、氨基酸結(jié)合從而獲得釋放，也可能是菌株分泌胞外磷酸酶溶解土壤中的難溶性磷，磷元素釋放的同時(shí)與之伴生的硒元素也被活化釋放，其活化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。相關(guān)研究表明，通過土壤微生物代謝轉(zhuǎn)化獲得的硒是一種重要的生物有效硒[16-17]，它在提高土壤硒生物有效性方面具有巨大的潛力。因此，土壤富硒細(xì)菌作為作物硒生物強(qiáng)化的潛在工具，在富硒作物生產(chǎn)上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表4 土壤處理后水溶態(tài)硒和可交換態(tài)硒含量

3 結(jié)論

從廣西多個(gè)富硒區(qū)分離篩選到4 株富硒能力較強(qiáng)的菌株：YLB1-6(玉林)、TXB1-10(藤縣)、TXB2-5 (藤縣)和GPB1-5(桂平)，經(jīng)16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，YLB1-6 為，TXB1- 10 為，TXB2-5為，GPB1-5 為，這些富硒細(xì)菌對硒的轉(zhuǎn)化率為55.31% ~ 74.22%，各菌株處理能顯著提高土壤可交換態(tài)硒含量，對土壤硒起到較強(qiáng)活化作用。在土壤微生物硒強(qiáng)化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Screening and Identification of Se-enriched Bacteria from Se-rich Soils in Guangxi

LIAO Qing, LIU Yongxian, XING Ying, LIANG Panxia, PAN Liping, CHEN Jinping, JIANG Zepu*

(Agricultural Resource and Environmental Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Selenium Enriched Agriculture Research Center of Guangxi, Nanning 530007, China)

32 Se-tolerance strains were isolated from Se-rich soils in Guangxi. Se-enriched test were conducted by optimizing the time of adding Na2SeO3, the incubation time and Na2SeO3concentration, and 4 bacterial strains with strong Se-enriched ability were screened out. Furthermore, the species of these 4 bacterial strains were determined based on the sequencing of 16S rDNA and phylogenetic analysis as(YLB1-6),(TXB1-10),(TXB2-5) and(GPB1-5), respectively. Under the condition of the optimum time of adding Na2SeO3, the suitable incubation time and optimal Na2SeO3concentration, the ratio of Se transformation of each strain was as follow: YLB1-6 74.22%, TXB1-10 66.05%, TXB2-5 55.31%, GPB1-5 63.30%. Furthermore, all strains treatments could significantly increase the exchangeable Se contents and have strong activating effect on soil Se. Soil Se-enriched bacteria provides more efficient microorganism carrier for Se transformation and provide technical support for Se-enriched products development.

Se-enriched bacteria; Ratio of Se transformation; Screening; Identification

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41761052)、廣西創(chuàng)新驅(qū)動重大專項(xiàng)項(xiàng)目(桂科AA17202019-1、桂科AA17202019-4、桂科AA17202026)、廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科AB16380207)、廣西農(nóng)業(yè)重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(201604)、廣西青年基金項(xiàng)目(2016GXNSFBA380131)、廣西富硒特色作物試驗(yàn)站項(xiàng)目(桂TS2016011)、廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目(2015YT33、桂農(nóng)科2017YZ03)和廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(桂農(nóng)科2017JM01，桂農(nóng)科2017JM03，桂農(nóng)科2018JZ21)資助。

(lzjeep@163.com)

廖青(1981—)，女，廣西梧州人，碩士，副研究員，主要從事土壤生態(tài)和高值農(nóng)業(yè)研究。E-mail: liaoqing81@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.06.023

Q939.9

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