侯思宇，宋 敏，閆陸飛，孫朝霞，韓淵懷，李紅英

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HPLC法測定谷子籽粒葉酸含量及種質資源評價①

侯思宇，宋 敏，閆陸飛，孫朝霞，韓淵懷*，李紅英

(山西農業(yè)大學農學院，山西太谷 030801)

谷子籽粒中富含葉酸，作為一種功能性食品深受北方人民的喜愛，而作物籽粒，如小米葉酸測定方法及含量分析存在較大差異，為小米品質鑒定及高葉酸谷子種質篩選造成了一定困難。本研究通過“三酶法”提取小米中的葉酸，建立了一種基于高效液相色譜技術(HPLC)高效化、規(guī)?；曳€(wěn)定適用于測定谷子籽粒葉酸含量的方法，對2016 年和2017年種植的45個谷子種質進行葉酸含量測定和分類評價。結果表明：葉酸標準品梯度曲線呈線性方程相關，相關系數為0.99；小米樣品葉酸測定過程中精密度、穩(wěn)定性和重復性的相對標準偏差(RSD)分別為0.81%、1.19% 和1.65%，各項指標符合精密測定標準，準確度高，重復性好；45個谷子種質籽粒葉酸含量分布范圍為0.26 ~ 2.56 μg/g(2016年度)和0.53 ~ 2.86 μg/g(2017年度)，含量均值分別為1.19和1.84 μg/g，標準差0.47和0.51 μg/g，變異系數39.5% 和27.7%；對上述種質進行正態(tài)分布曲線分析，發(fā)現葉酸含量整體呈現偏度分布；從中篩選出9個高葉酸(含量≥1.91 μg/g)和3個低葉酸(含量≤1.15 μg/g)的谷子種質。上述結論為小米葉酸含量提供了測定標準和評價體系，也為高葉酸谷子種質創(chuàng)新與利用奠定了基礎。

谷子；高效液相色譜法；葉酸；種質資源

葉酸(folic acid)，又稱維生素B9，參與生物的一碳代謝[1]。在植物中，葉酸所介導的一碳代謝反應涉及生物體內核酸、氨基酸和泛酸鹽等代謝功能，還促進植物木質素合成和光呼吸，具有廣泛的生物學意義[2-3]。葉酸對人類營養(yǎng)和健康有著不容忽視的作用，尤其是預防新生兒先天疾病方面具有重要意義[4]。另外，最新的研究表明，葉酸在抑郁癥[5]、阿茲海默癥[6]、慢性胃酸性胃炎[7]等疾病的治療和預防方面都有一定的功效。植物、真菌和大多數細菌都具備從頭合成葉酸的能力，但是高等動物包括人類卻無法自身合成葉酸，其來源完全依賴日常飲食攝入，從而完成體內生理生化代謝過程[8]。為了彌補葉酸缺乏，我國自1998年起開始了葉酸強化政策，規(guī)定在小麥面粉中添加量為1 ~ 3 mg/kg[9]。盡管當前市場能夠提供多種富含葉酸食品，且多個國家(包括中國)也制定了免費發(fā)放葉酸片劑以滿足葉酸缺乏人群的相關政策，但對于多數發(fā)展中國家，尤其是偏遠地區(qū)，由于飲食習慣等原因導致部分人群仍然嚴重缺乏葉酸。

谷子((L.) P. Beauvois)是重要的雜糧作物，也是“老少邊窮”地區(qū)重要作物，其籽粒脫殼后稱之為“小米”，富含多種營養(yǎng)物質。在山西、陜西、河北、內蒙、東北等地，一直有種植谷子的傳統(tǒng)，尤其深受孕婦和老人喜愛。隨著“健康中國”理念的深入人心，人們日常攝入食物的多樣性日益增加，谷子作為葉酸強化食品原料也越來越被普通大眾認可[10]。尤其是種植于山西地區(qū)的小米本身具有高葉酸含量這一獨特品質，越來越受到人們的喜愛。目前，在植物葉酸提取工藝優(yōu)化[11]、營養(yǎng)價值評價[12]及作物轉基因葉酸育種[13-17]等研究方面已取得一些成果。盡管已報道了一些植物葉酸提取方法，如單酶法[18]、水浴浸提法[19]、超聲提取法[20]和三酶法[21]等，但有關谷子籽粒葉酸測定的報道較少。本試驗優(yōu)化了一種適用于谷子籽粒葉酸提取的三酶法，同時建立了高效液相色譜(high performance liquid chromato-graphy, HPLC)測定葉酸的方法，并基于這種穩(wěn)定可靠和規(guī)?；崛〃C測定葉酸的最優(yōu)方法，對45份谷子種質進行了葉酸分類評價，為評價優(yōu)異谷子種質，尤其是評價高葉酸谷子種質提供了方案及標準。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及種植情況

收集了45個谷子種質資源，于2016年和2017年種植于山西農業(yè)大學農學院試驗站2個不同地塊中(37°42￠N，112°58￠E)，成熟期收獲谷子單穗，并脫粒作為試驗材料。供試土壤為黃壤土，參考董建江等[22]和劉釗等[23]方法，測定了2個試驗地原始土壤肥力特性(表1)。

1.2 谷子籽粒葉酸提取方法

參考孟繁磊等[24]采用三酶法提取大豆籽粒葉酸方法，針對小米葉酸提取略有改動。如：將小米研成粉末過100目篩子；葉酸提取液依次加入8 μl α–淀粉酶、70 μl蛋白酶和2%大鼠血清(活性炭過濾)。

表1 試驗土壤主要肥力特性

1.3 HPLC法測定葉酸標準品及樣品

精確稱取0.01 g葉酸標準品，用0.1 mol/L KH2PO4(pH 7.0，1% 抗壞血酸，0.1% β-巰基乙醇)溶解定容至10 ml，得到濃度為1 μg/μl的葉酸標準品母液，從中吸取1 μl定容至1 ml，即葉酸標準液濃度為1 ng/μl；分別吸取葉酸標準液1、2、4、6、8、10、16、20、30、50 μl定容至1 ml，分別即為1、2、4、6、8、10、16、20、30、50 ng/μl；經0.45 μm濾膜過濾后放于棕色進樣瓶中，4 ℃避光放置備用，得到濃度為1 ~ 50 ng/μl葉酸標準品溶液，設置3次重復并記錄峰面積平均值。橫坐標為進樣葉酸含量，縱坐標峰為面積繪制標準曲線。

葉酸測定色譜條件：配置的流動相為0.01 mol/L KH2PO4:CH3OH(89:11，pH 6.3)；液相色譜儀設定柱溫25 ℃；流速為1.0 ml/min；進樣量為20 μl；紫外檢驗波長280 nm；使用C18色譜柱(4.6 nm×150 nm×5 μm)進行分析。

以‘晉谷21’為檢測樣品，針對葉酸的精密度、穩(wěn)定性和重復性進行分析。

1.4 數據統(tǒng)計分析

所有測定樣品的數據采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 葉酸標準曲線建立及色譜圖分析

以葉酸標準品含量為橫坐標，所對應峰面積為縱坐標繪制葉酸標準曲線，并計算得到線性回歸方程為=0.721 2+0.561 1，其絕對系數2= 0.998 8。結果表明，谷子葉酸標準品的含量與峰面積呈線性對應關系，葉酸在1 ~ 50 ng/μl范圍內線性關系良好。對比葉酸標準品及谷子籽粒提取樣品色譜圖(圖 1A和1B)，結果表明，葉酸標準品峰型保留時間在3.24 min，其峰型單一，峰尖銳利，結果表明標準品純度較高，無雜質殘留。相比標準品測定色譜圖，小米樣品，保留時間1 ~ 3 min存在雜峰，在3.24 min可檢測到峰型，其峰型與葉酸標準品一致，且峰形銳利。以上結果表明，采用高效液相色譜的方法可以準確檢測到谷子葉酸組分，并進行相對定量，并為后續(xù)測定谷子葉酸含量試驗奠定基礎。

2.2 葉酸樣品精密度、穩(wěn)定性及重復性檢測

對30 ng/μl的葉酸溶液和晉谷21浸提液分別平行進樣5次，記錄峰面積，測得標品和樣品的葉酸峰面積平均值分別為22.34 mAU和18.75 mAU，相對標準偏差RSD值分別為0.79% 和0.81%，均<1 %(表2)，表明本試驗儀器精密度較好，可用于進行相關測定試驗。

在測定的12 h內，樣品浸提液每隔2 h進樣一次并記錄峰面積，測得RSD為1.19%，<2%(表3)，符合中華人民共和國藥典中重現性RSD<2% 的要求；5次樣品浸提液峰面積的平均值為18.71 mAU，RSD為1.65%(表4)，說明樣品提取的重復性較好，數據重現性較好，穩(wěn)定性高。

2.3 谷子葉酸含量差異分析與種質評價

如表5和圖2所示，2016年種植于試驗田I的小米葉酸含量整體呈正態(tài)分布，變化幅度為0.26 ~ 2.56 μg/g，中位值為1.25 μg/g，平均含量為1.19 μg/g，變異系數為39.5%；該年不同谷子種質葉酸含量正態(tài)分布曲線顯示，其偏度系數為0.2(>0)，葉酸含量測定值重尾在右側為右偏態(tài)，峰度系數為0.28，說明多數品種的葉酸含量大于平均值。同樣的，2017年小米葉酸含量也呈正態(tài)分布，變化幅度為0.53 ~ 2.86 μg/g，中位值為1.92 μg/g，平均含量為1.84 μg/g，變異系數為27.7%，較上一年高。而2017年谷子葉酸偏度系數和峰度系數分別為-0.26和-0.36(均<0)，說明葉酸含量正態(tài)分布曲線重尾在左側為左偏態(tài)，且多數品種的葉酸含量小于平均值1.84 μg/g。通過比較2016年和2017年種植的小米葉酸含量的各項統(tǒng)計值，發(fā)現這兩年的葉酸含量差異較大。

(A. 葉酸標準品；B. 谷子籽粒提取樣品)

表2 精密度試驗結果

表3 穩(wěn)定性試驗結果

表4 重復性試驗結果

表5 谷子葉酸含量統(tǒng)計(μg/g)

圖2 2016年和2017年45份谷子品種葉酸含量整體分布

以平均值和標準差為判斷依據，將含量≥1.91 μg/g的定為高葉酸品種，≤1.15 μg/g的定為低葉酸品種，其中高葉酸谷子種質有：B360、SX32、豫谷1號、晉汾52、晉谷29、B387、晉谷35、長生08和晉谷21等；低葉酸谷子種質主要有：平定大谷、SX39和B185(表6)。

表6 部分高、低葉酸含量谷子種質(μg/g)

3 討論

本試驗首次采用三酶法對小米的葉酸進行提取，與前人曾采用的水浴浸提法相比[25]，二者都選用磷酸緩沖溶液作提取液，不同點是水浴浸提法采用化學方法，用活性炭吸附葉酸后再依次洗脫；而本文采取較溫和的生物酶解法，先用α-淀粉酶去糊化，再用蛋白酶去蛋白，最后采用大鼠血清將多聚谷氨酸葉酸水解成單谷氨酸葉酸。由于葉酸提取過程中很容易被氧化降解，而三酶法反應溫和，相比其他化學方法可以較好保護葉酸，防止其被氧化，并且被很多學者應用于其他作物的葉酸提取。孟繁磊等[24]和董薇[26]研究采用各自優(yōu)化的體系分別對大豆種子和大米籽粒進行總葉酸提取，可見三酶法是目前作物葉酸提取的首選方法。另外，目前測定葉酸的主要方法有高效液相色譜法、微生物檢測法以及間接熒光法。邵麗華和王莉[25]采用間接熒光法測定小米葉酸雖然能測定出葉酸總含量，但相對標準偏差為1.68%，本試驗為0.30%，因此高效液相色譜法測定葉酸精確度更高。此外前人報道微生物檢測法的重復性較差，而本研究中采用高效液相色譜法測定葉酸的重復性和精密度都較好。

酵母、肝臟等動物類食品中富含較多葉酸，而綠葉蔬菜和豆類等植物類食品也富含葉酸，相比之下，谷類作物其葉酸含量較低。本研究對45份谷子種質資源籽粒進行總葉酸含量測定，綜合兩年測定數據，分析表明小米葉酸含量變幅為0.23 ~ 2.86 μg/g，平均葉酸含量為1.52 μg/g。相關研究表明，不同品種糙米和精米的葉酸含量，其變化幅度分別為0.133 ~ 1.114 μg/g和0.103 ~ 0.777 μg/g[26]。大豆籽粒葉酸含量為1.436 ~ 3.096 μg/g[24]。主要糧食的葉酸含量在0.39 ~ 2.63 μg/g范圍內，其中大豆＞花生＞綠豆＞小米＞燕麥＞玉米＞苦蕎＞黍米＞面粉＞薏米＞大米[25]。同時研究發(fā)現豆類遠遠大于谷物或玉米，最少的是糙米和大米[26]。由此可見，在主要的作物中，小米葉酸含量僅次于大豆，為滿足成年人日均葉酸最佳攝入量400 μg以及孕婦600 μg的需求量，建議要均衡飲食，平時要多攝入豆類以及蔬菜等富含葉酸的食物，尤其是青少年、老人以及孕婦等容易缺乏葉酸的人群。

此外，谷子不宜重茬，因此本試驗選用不同地塊種植，45份谷子資源葉酸含量測定，發(fā)現兩年間谷子籽粒葉酸含量差異較大。其原因可能為谷子籽粒葉酸含量與土壤條件有一定關系，同一品種的谷子因為種植土壤的條件不同，葉酸含量也存在較大差異，如晉谷21在2017年的葉酸含量為2.00 ± 0.02 μg/g，而2016年的葉酸含量卻為1.46 ± 0.15 μg/g，兩者葉酸含量存在明顯差異。前人研究發(fā)現不同生態(tài)條件下，小米葉酸含量有明顯差異，這表明小米的葉酸含量不僅與品種差異有關，還可能與土壤條件、氣候、生態(tài)環(huán)境等因素有關，同時研究發(fā)現小米葉酸含量與米色差異有關[27]，因此我們下一步計劃探究米色色澤與葉酸以及類胡蘿卜素之間的分子機理，為以后打造山西功能性小米的發(fā)展做鋪墊。

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Evaluation and Detection of Folic Acid Content of Seeds Among Foxtail Millet Accessions by HPLC Method

HOU Siyu, SONG Min, YAN Lufei, SUN Zhaoxia, HAN Yuanhuai*, LI Hongying

(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

Foxtail millet is a kind of functional food rich in folic acid, and it is popular in the northern China. However, there are significant differences in folic acid contents in crop grains, such as the determination method and content analysis of folate in Foxtail millet, which make it difficult to identify the quality of millet and select the germplasm with high folate content. In this study, ‘triple-enzymes method’ was used to isolate folic acid from foxtail millet grains and construct a large-scale detection method by HPLC for folic acid content. Meantime, the folic acid contents were assessed among 45 accessions of foxtail millet in 2016 and 2017. The results showed that: based on HPLC, a folic acid content determination method for foxtail millet was successfully established. Folic acid standard curve showed the linear correlation between folic acid standard and peak area value, the correlation coefficient was 0.99. The relative standard deviation (RSD) was used to evaluate the precision, stability and repeatability in the detection process of folic acid content, and they were 0.81%, 1.19% and 1.65%, respectively. The range of grain folic acid content of 45 millet varieties were 0.26 ~ 2.56 μg/g in 2016 and 0.53 ~ 2.86 μg/g in 2017, with average values of 1.19 and 1.84 μg/g, standard deviation of 0.47 and 0.51 μg/g, and variation coefficient of 39.5% and 27.7%, respectively. The gaussian distribution had a little skewness. Finally, 9 high folic acid (folate content≥1.91 μg/g) and 3 low folic acid (folate content≤1.15 μg/g) accessions were screened from 45 millet accessions, respectively. This study not only provided the standard determination and evaluation system of folate in foxtail millet, and also laied a foundation for the innovation and utilization of high folate germplasm of foxtail millet.

Foxtail millet; HPLC; Folic acid; Germplasm resource

山西省農谷建設科研專項項目(SXNGJSKYZX201702)資助。

(swgctd@163.com)

侯思宇(1980—)，男，山西陵川人，博士，副教授，主要從事谷子營養(yǎng)品質研究。E-mail: 18635068055@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.06.028

S515；S326

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