張珂 張聰 高靜 王海辰 韓彩娜 張微 劉俊峰

食管下括約肌(lower esophageal sphincter，LES)的位置大致在食管胃結合部，而與其他哺乳動物不同的是人食管下端寬約3 cm的環(huán)形增厚平滑肌束，包含有兩種肌纖維，即靠近胃小彎一側的勾狀纖維肌束(clasp fibre)和靠近胃大彎一側的套索纖維肌束(sling fibre)。最初結構成分特征由Allgower等于1979年首次報道。目前多數(shù)學者通過大量解剖研究對于兩種纖維束結構特征的共識是，鉤狀纖維形狀為半環(huán)形，套索纖維斜行走行[1]。通過多種神經(jīng)、體液因素調節(jié)，兩種肌纖維同膈肌腳共同形成了食管下高壓帶(high-pressure zone，HPZ)這一生理抗反流解剖結構，具有防止食管—胃反流發(fā)生的生理功能。

目前認為人LES的功能受三種機制共同調節(jié)。

第一是神經(jīng)調節(jié)機制，人腦接受到刺激信號后進行信息整合分析，然后將信息傳至迷走神經(jīng)背核神經(jīng)元胞體，經(jīng)過進一步分析整合后再通過迷走神經(jīng)的末梢將神經(jīng)刺激傳遞到人食管下括約肌。興奮性和抑制性傳導通路末梢均與LES肌層內(nèi)腸道運動神經(jīng)元(enteric motor neurons，EMN)形成突觸連接，共同調節(jié)人LES的收縮與舒張[2-3]。

第二是人LES自身調節(jié)機制，也稱為肌源性調節(jié)機制。是人LES肌層中神經(jīng)細胞叢和神經(jīng)纖維網(wǎng)共同調節(jié)而形成的調節(jié)機制。這種調節(jié)機制是通過對離體肌條靜息張力的研究發(fā)現(xiàn)的。體外實驗發(fā)現(xiàn)，肌條的部分靜息張力不能被河豚毒(tetrodotoxin，TTX)作用后消除，只可以被硝普鈉所消除。該實驗表明靜息長度張力效應是人LES的自身調節(jié)機制作用所產(chǎn)生。

人LES除受神經(jīng)刺激調節(jié)和自身調節(jié)控制以外，第三個重要的調節(jié)因素就是體液調節(jié)機制。在人LES上體液調節(jié)主要是通過激素配體與G蛋白耦聯(lián)受體結合而發(fā)揮作用的。因此，全面掌握人LES上G蛋白耦聯(lián)受體的表達量和表達類型，并進一步明確G蛋白耦聯(lián)受體激動或拮抗后的平滑肌行為對于研究食管動力性疾病尤為重要[4]。

一、G蛋白耦聯(lián)受體的結構

跨膜信號轉導有三類主要方式：①特殊刺激激活通道蛋白質完成信號轉導；②G蛋白耦聯(lián)受體介導的跨膜信號轉導；③受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)介導的跨膜信號轉導。第二類信號轉導機制由G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)介導，其胞內(nèi)的G蛋白(G-protein/GTP binding protein)，又稱鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(guanine nucleotide-Binding protein)，是細胞膜表面上的蛋白質，為信號轉導細胞跨膜信息傳遞系統(tǒng)的起始端，幾乎全部多肽類激素配體是通過與G蛋白耦聯(lián)受體結合后，在突觸后細胞中生成第二信使再經(jīng)信號轉導通路進而調節(jié)細胞生理功能的。另外一些激活的G蛋白耦聯(lián)受體可調控一些通道狀態(tài)。

1.結構：G蛋白耦聯(lián)受體的結構為膜內(nèi)在蛋白(integral membrane protein)，每個受體有7個跨膜α螺旋的結構域。當膜外結構與配體結合后，膜內(nèi)部分發(fā)生構象變化，G蛋白結合位點與G蛋白相互作用以實現(xiàn)胞外信息向胞內(nèi)信息的傳遞。G蛋白是胞質側膜蛋白，其與膜受體耦聯(lián)的部分通常由3個亞基組成異源三聚體。其中包含45 000的α亞基、35 000 的β亞基和70 000的γ亞基，總分子質量為100 000左右。α亞基為催化作用單元，當G蛋白處于失活狀態(tài)，α亞基結合一個分子的GDP；當受體蛋白激活后G蛋白α亞基和GDP分離，再與一分子GTP結合。這時結合GTP的α亞基同β、γ亞基分離，G蛋白各亞基處于激活狀態(tài)，對膜結構的效應酶起作用。效應酶抑制或激活使胞質中第二信使生成減少或增加以實現(xiàn)信號轉導。由此可知，G蛋白有兩種狀態(tài)，即結合GDP的αβγ三聚體非活化型狀態(tài)和α亞基-GTP、β、γ亞基的活化型狀態(tài)。G蛋白是一個超級家族(GTP-binding protein superfamily)，均包含有異源三聚體和小G蛋白。作為受鳥嘌呤核苷酸調控的信號轉導分子，三聚體分子量大；小G蛋白分子量在20 000～30 000水平，相對較小且為單體，其與信號轉導之間聯(lián)系目前尚未發(fā)現(xiàn)[5-6]

2.分類：三個主要類型為刺激型G蛋白(stimulatory G protein，Gs)、抑制型G蛋白(inhibitory G protein, Gi)和磷脂酶C型G蛋(PI-PLC-G protein，Gp)。不同類型的G蛋白能與相應的效應酶特異性耦聯(lián)以實現(xiàn)不同效應。G蛋白沒有跨膜結構域，其通過氨基酸殘基脂化修飾以錨定在胞膜上。在各種G蛋白亞基中，Linder、Hepler等建議以差別最大的α亞基分類作為G蛋白分類依據(jù)。目前通常結合氨基酸序列、G蛋白結構、功能性和進化相似性等幾個方面綜合判斷作為分類依據(jù)，主要分為4類G蛋白。其中至少分別存在21、5和8種不同的α、β、γ亞基。α螺旋鏈主要有αs、αi、αo、αt1、αt2五種類型。cDNA克隆可發(fā)現(xiàn)5條α鏈的原始序列[6-8]。

二、G蛋白耦聯(lián)受體的功能

不同類型的α亞基均有鳥嘌呤核苷酸結合區(qū)，其可與GTP或GDP結合。與鳥嘌呤核苷酸(GTP、GDP)的結合可逆，使G蛋白在G蛋白耦聯(lián)受體的信號轉導過程中發(fā)揮“開關”作用。跨膜信息傳遞有如下步驟：①胞外無刺激信號或配體時G蛋白處異源性三聚體形式失活狀態(tài)存在。α亞基與GDP緊密結合，β、γ亞基則與α亞基-GDP疏松結合。②外部存在刺激時受體與配體結合，進而導致G蛋白α亞基變化，使得三個亞基緊密結合為αβγ復合物，使GDP與GTP交換。與GTP結合后α亞基與β、γ亞基分離，轉化為α亞基-GTP激活態(tài)作用于效應器，繼而出現(xiàn)細胞內(nèi)信號轉導引起細胞生理變化。③G蛋白α亞基在Mg離子存在時具有GTP水解酶活性，水解后α亞基-GDP再次與β、γ亞基結合重新恢復失活態(tài)。上述過程往復循環(huán)實現(xiàn)信號跨膜傳遞，α亞基的GTPase活性高低決定了激活狀態(tài)持續(xù)時間，進而說明了G蛋白在信號轉導過程至關重要。G蛋白耦聯(lián)受體信號通路多數(shù)為cAMP和磷脂酰肌醇信號通路。也有研究證實，G蛋白同時參與磷脂代謝的生理過程和光信號轉導過程。信號轉導過程中G蛋白有信號放大和分子開關兩個主要作用。①通常一個受體可以級聯(lián)放大激活許多G蛋白實現(xiàn)跨膜傳遞信息；此外，有時細胞外配體與受體結合短暫，難以形成足夠的放大作用。而胞內(nèi)G蛋白激活時間可持續(xù)10～15 s，受體配體已經(jīng)分離時G蛋白仍處于向細胞內(nèi)傳遞信號的激活狀態(tài)。②G蛋白與GTP的結合啟動了信號轉導通路，因此其具有分子開關作用。此外，G蛋白的共價修飾及其濃度變化同樣會改變受體、酶間耦聯(lián)的有效性。例如，百日咳毒素催化Gi的α亞基ADP核糖基化而降低了GTP-Gi結合力，使Giα亞基不能活化，從而使腺苷酸環(huán)化酶保持活化狀態(tài)。正常生理時，G蛋白與GTP、GDP結合狀態(tài)可逆，使信號精確、適度地瞬間內(nèi)傳遞，而不是持續(xù)存在，正負反饋機制一旦被破壞細胞就會出現(xiàn)功能障礙。因此G蛋白在信號轉導過程中的放大作用需要控制，不能無限放大，進一步體現(xiàn)了G蛋白的分子開關作用。另外，G蛋白也可誘導細胞調亡。

三、G蛋白耦聯(lián)受體的主要效應器

1.腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)是研究最早、最多的G蛋白調節(jié)效應器之一。受體激活后催化與Gs結合的GDP替換為GTP，導致Gs的α亞基與β、γ亞基分離并釋放出AS-GTP活化腺苷酸環(huán)化酶，進而催化ATP轉化為cAMP。腺苷酸環(huán)化酶被Gs激活，被Gi抑制。

2.磷脂酶C是G蛋白的直接效應器，有4個同工酶。5-羥色胺等激素配體與受體結合后經(jīng)GPLC蛋白轉導可激活磷脂酶C。而磷脂酶C可催化胞質側磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2]水解產(chǎn)生二酰甘油(diacylglycerol，DG)與肌醇三磷酸(inositol triphosphate，IP3)。DG與IP3都是細胞內(nèi)重要的第二信使。其中IP3可進入胞質中的內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)使Ca2+離子大量釋放到胞質中。IP3也可增強胞膜對Ca2+離子的轉運促使Ca2+離子內(nèi)流以提高胞質內(nèi)Ca2+離子濃度。其還可激活依賴Ca2+-CaM的蛋白激酶(PK)，通過Ca2+-CaM蛋白激酶催化蛋白質磷酸化表現(xiàn)不同的效應。但IP3的壽命僅數(shù)秒，可被三種磷酸酶催化變?yōu)榧〈?，因此是一種短時效信使物質。DG脂溶性強，可活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)發(fā)揮作用。PKC多肽鏈上有親水的催化活性中心和疏水的膜結合區(qū)兩個功能域。PKC主要分布于胞質，當細胞接收到刺激信號使PIP2分解生成IP3和DG，導致質膜中DG含量瞬間積累。PKC與DG結合在質膜內(nèi)表面，并在Ca2+和磷脂酰絲氨酸共同作用下使PKC激活，DG的結合還可使PKC對Ca2+的親和力大幅提高。這就使得在生理濃度Ca2+水平PKC即可被激活，激活的PKC進一步修飾某些蛋白質或酶的磷酸化反應，表現(xiàn)其信息效應。

3.G蛋白調節(jié)離子通道：Gαs亞基被證明至少可抑制心肌Na離子通道和調節(jié)骨骼肌細胞中的Ca離子通道這兩種通道，而Gαi也能抑制Ca離子通道而激活K離子通道。在活化心肌上K離子通道能力方面Gβγ比Gαi更高效。此外，所有G蛋白均能長期調節(jié)細胞生長和基因表達，由異源三聚體G蛋白途徑轉導的信號最終導致核轉錄因子的磷酸化[5]。

四、G蛋白耦聯(lián)受體的分類及其在人食管下括約肌上的表達

G蛋白耦聯(lián)受體的分類：以G蛋白耦聯(lián)受體一級結構的同源性為分類標準可將其分為A、B、C三系[9]。

1.A族(視紫紅質/β腎上腺素受體樣受體族)的一級結構和特點：ECL1與ECL2間有二硫鍵；N末端氨基酸殘基數(shù)少；TM3胞質面具有保守的DRY基礎序列(Asp-Arg-Tyr)；棕櫚?；疌ys位于C末端，形成ICL4；ICL3較長；在7跨膜α螺旋結構中包含多個高度保守的氨基酸序列。A族受體以種系發(fā)生為判定標準可再分為6個亞族：①速激肽、神經(jīng)肽Y、膽囊收縮肽、內(nèi)皮素等；②生物胺受體；③大麻類、腺嘌呤、嗅覺及黑皮素受體；④緩激肽和非脊椎動物的視蛋白受體；⑤互補因子、促性腺激素釋放激素、趨化因子等；⑥褪黑激素受體及其他類型受體。

2.B族(胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族)包含有4個亞族：①促腎上腺皮質激素釋放因子和降鈣素受體；②類胰高血糖素肽、胰高血糖素、血管活性腸肽、分泌素和垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽受體；③甲狀旁腺激素受體；④Latrotoxin受體。

3.C族包含有主要鈣受體、味覺受體、鼻神經(jīng)外激素受體、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸受體這5個亞族。上述各種類型受體廣泛分布于體內(nèi)并參與信號傳遞、學習和記憶等重要的生理功能，同時與帕金森癥、癲癇等疾病的病理發(fā)生機制密切相關[10]。

三、調節(jié)人LES的主要激素配體及其G蛋白耦聯(lián)受體表達

人LES的體液調節(jié)主要通過激素類配體與受體的結合實現(xiàn)信息傳遞和生理功能調節(jié)。既往多項研究發(fā)現(xiàn)，體液中存在的激素類物質可影響人LES的靜息張力，進一步研究發(fā)現(xiàn)人LES上存在多種G蛋白耦聯(lián)受體表達。因此推斷，通過開發(fā)與人LES上G蛋白耦聯(lián)受體結合的藥物可能實現(xiàn)治療食管動力性疾病的目的。

1.速激肽及NK類受體：張珂等發(fā)現(xiàn)在人LES、胃小彎和食管下段環(huán)形肌上NK受體均有表達。NK1、NK2和NK3受體分別由TACR1、TACR2和TACR3基因編碼，其受體蛋白表達量NK2>NK1>NK3[10]。速激肽類物質包含有神經(jīng)激肽B(neurokinin B，NKB)、P物質(substance P)和神經(jīng)激肽A(neurokinin A，NKA)，通過與NK類受體結合以實現(xiàn)調節(jié)LES肌張力作用。有作者研究表明，靜脈注射P物質使其在血液濃度一過性增高時，隨著濃度增加，人LES肌張力隨之增大。通過藥理學實驗發(fā)現(xiàn)毒蕈堿受體在此過程發(fā)揮主要作用，而靜注NKA也有同樣效果，但其作用機制并不依賴于膽堿能信號傳輸系統(tǒng)。另外，多篇文獻研究發(fā)現(xiàn)，人LES的體液調節(jié)速激肽類物質為主要調節(jié)因子[11-12]。

2.蛙皮素(bombesin，BBS)：最初研究認為其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質，后期實驗發(fā)現(xiàn)通過誘導各種胃腸激素釋放其具有調節(jié)LES舒縮作用，并且這種對LES的調節(jié)不會被酚妥拉明、阿托品所阻斷[14]。BBS相關肽和雨蛙素對正常人LES平均壓力有下調作用，而對賁門失馳緩癥患者的LES平均壓力具有升高作用[14]。但其在所有體液調節(jié)中所占比重大小目前尚不清楚。

3.膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、胃動素和胃泌素也可使人LES收縮。研究還發(fā)現(xiàn)CCK靜注犬類體內(nèi)對LES張力無影響，但在犬胃膨脹前靜注CCK拮抗劑會降低LES松弛[15]。胃動素作為有22個氨基酸的胃腸多肽激素除了可以使人LES收縮外，還能夠使胃腸道動力提高。其作用是通過與LES平滑肌上的胃動素受體結合實現(xiàn)的，這一結合可被阿托品和六甲季銨所拮抗[16-17]。高立平等[18]和Perdikis等[16]在實驗中發(fā)現(xiàn)，胃泌素可使LES肌張力升高。但Nelson等[19]發(fā)現(xiàn)胃泌素可能與胃食管反流病患兒的LES壓力下降之間存在重要關聯(lián)。胃泌素對LES的作用尚須更深入的研究。5-羥色胺、前列腺素、生長抑素β腎上腺素、溶血磷脂酸和促胰液素這幾類胃腸道激素類物質受體在人LES上葉均有不同程度表達，但研究發(fā)現(xiàn)這些胃腸激素物質對LES的舒縮調節(jié)作用均較小[20-23]。

隨著研究的不斷進展，未來食管胃結合部的功能也會進一步明確。隨著神經(jīng)、自身和體液激素對LES的調節(jié)作用不斷被發(fā)現(xiàn)，未來食管動力性疾病的藥物治療方法可能會取代外科手術。