■劉 驥 易春霞 韓業(yè)東 王 燕*

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧沈陽110030）

我國蛋白飼料短缺現(xiàn)象嚴(yán)重，亟需開發(fā)新型富有 營養(yǎng)的蛋白飼料，因此微生物發(fā)酵改性玉米蛋白粉前景非?？捎^[1]。玉米可溶性蛋白包括玉米醇溶蛋白、玉米黃色素、玉米抗氧化肽、玉米降壓肽、高F值寡肽和玉米蛋白活性肽等[2]，提高其可溶性蛋白含量，可以增加其功能性。鄭喜群等用堿性蛋白酶和米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)生的羧肽酶分別水解玉米醇溶蛋白，制備高F值寡肽[3]。秦旭東等在配合飼料中添加50%提取醇溶蛋白后的玉米蛋白粉飼喂生長豬，試驗組較對照組體重增長的多[4]。吳澤柱采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米蛋白粉，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶使玉米蛋白粉的水解度顯著提高[5]。

近年來，對水解蛋白的功能性進行了大量研究，許多研究表明，酶解玉米蛋白粉具有抗氧化活性肽?？寡趸钚噪目梢郧宄w內(nèi)多余的自由基，自由基本身是無害的電子，是體內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物。但是如果體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)不能代謝多余的自由基，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞和產(chǎn)生疾病，例如腹瀉等。當(dāng)發(fā)生仔豬腹瀉時，一般我們采用抗生素來治療疾病，但是抗生素的添加會在畜產(chǎn)品中殘留，易引起食品安全隱患。添加抗氧化肽可以減少疾病的發(fā)生，減少抗生素的添加。

玉米蛋白粉特殊的氨基酸序列使其具有產(chǎn)生抗氧化肽的潛力。本文采用酵母菌發(fā)酵玉米蛋白粉，尋找最佳的發(fā)酵工藝，提高其溶解性和利用率，并測定其抗氧化活性，確定其功能性。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基配制及菌種培養(yǎng)

采用產(chǎn)朊假絲酵母進行發(fā)酵，采用PDA培養(yǎng)基進行菌種的活化和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

本文采用酵母菌發(fā)酵玉米蛋白粉，以可溶性蛋白為指標(biāo)，優(yōu)化工藝條件，尋找最佳的發(fā)酵工藝。

①料液比條件的確定

初始條件：玉米胚芽餅、玉米黃粉、玉米DDGS和麩皮按2∶1∶1∶1的固料比例加入到250 ml錐形瓶中，固料和水共50 g/250 ml錐形瓶，外加營養(yǎng)成分尿素、硫酸銨、糖蜜各0.5 g/250 ml錐形瓶。接菌量為6%、發(fā)酵時間為96 h、發(fā)酵溫度為33℃。設(shè)置料液比梯度為：1∶0.8，1∶1，1∶1.25，1∶1.4，1∶1.6。每組三個平行實驗。

②接種量條件的確定

條件同上。設(shè)置接菌量梯度為：2%、4%、6%、8%、10%。每組3個平行實驗。

③發(fā)酵時間條件的確定

條件同上。設(shè)置發(fā)酵時間梯度為：48、72、96、120、144 h。每組3個平行實驗。

④發(fā)酵溫度條件的確定

條件同上。設(shè)置發(fā)酵溫度梯度為：29、31、33、35、37℃。每組3個平行實驗。

1.2.2 正交試驗

在單因素試驗確定的各因素的最佳工藝參數(shù)范圍的基礎(chǔ)上以L9（34）因素水平表，進行測定。

1.2.3 評價指標(biāo)

可溶性蛋白含量采用福林酚法[6]。

1.2.4 發(fā)酵后玉米蛋白粉的蛋白的分子量分布

SDS凝膠電泳的操作方法參照劉成江等[7]的方法。

1.2.5 抗氧化性的測定

參照Zhang等[8]的方法，準(zhǔn)確稱取肽，用蒸餾水分別配制成0.5、1、1.5、2、4、6 mg/ml和8 mg/ml的樣品溶液。取1 ml樣品溶液加入試管中，加入0.1 ml 2 mM FeCl2溶液，混勻后加入3.7 ml雙蒸水，然后加入0.2 ml 5 mM菲啰嗪溶液，震蕩搖勻，反應(yīng)混合物在室溫下放置10 min，在562 nm處測吸光值，以雙蒸水代替樣品作空白對照。

式中：AS——加樣品時在562 nm處測吸光值；

AC——加雙蒸水時在562 nm處測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比條件的確定

圖1 料液比對產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

由圖1可以看出，當(dāng)料液比為1∶1時，產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物的可溶性蛋白含量最高，可達到75.34 mg/g。

2.2 接種量條件的確定

由圖2可見，當(dāng)接種量為8%時，產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物的可溶性蛋白含量最高，可達到88.45 mg/g。

2.3 發(fā)酵時間的優(yōu)化

由圖3可以看出，當(dāng)發(fā)酵時間為120 h時，產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物的可溶性蛋白含量最高，可達到91.56 mg/g。

2.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時，產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物的可溶性蛋白含量最高，可達到109.01 mg/g。

圖2 接種量對產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

圖3 發(fā)酵時間對產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

圖4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)阮假絲酵母菌發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

2.5 正交試驗數(shù)據(jù)及分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上選擇對單因素條件影響較大的因素（料液比、接種量和發(fā)酵時間）設(shè)計正交水平試驗，對各因素組合進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗水平

由表2中極差分析可知，可溶性蛋白含量測定時，RA＞RB＞RC，即在正交試驗的3個因素中料液比的影響最大，其次是接種量和發(fā)酵時間。

表2 產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

通過可溶性蛋白含量各水平的和（K1、K2、K3）可知，K1＞K2＞K3，說明料液比1水平為最佳；不同水平接種量的可溶性蛋白的和為K1＞K2＞K3，說明1水平最佳；不同水平的發(fā)酵時間的可溶性蛋白的和K2＞K1＞K3，說明2水平最佳。通過正交試驗的顯著性檢驗表3可知，該模型的擬合度是0.984，且模型是顯著的，說明該正交試驗的數(shù)據(jù)真實有效。通過正交試驗，綜合得出最佳組合為：料液比1∶1.5，發(fā)酵時間120 h，接種量15%。通過試驗驗證得到正交最高可溶性蛋白是95.33 mg/ml。

表3 正交試驗的顯著性檢驗

2.6 發(fā)酵前后蛋白分子量的分布

通過圖5可以看出，經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后的蛋白質(zhì)的分子量明顯減少，超過31 000 Da的蛋白明顯減少，而小于31 000 Da的蛋白明顯增加，說明發(fā)酵使蛋白的分子量降低，使一些不溶的大分子肽轉(zhuǎn)變成可溶的小分子肽。

圖5 蛋白質(zhì)電泳圖

2.7 抗氧化活性測定結(jié)果

Fe2+與Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，能夠縮短鏈反應(yīng)引發(fā)期的時間，且加快脂類化合物過氧化的反應(yīng)速度。因此，當(dāng)物質(zhì)與金屬離子發(fā)生螯合作用后，就可以減弱金屬離子促進脂肪過氧化作用，間接地發(fā)揮了抗氧化的效果。

圖6 玉米肽和乙二胺四乙酸同F(xiàn)e2+的螯合能力

如圖6所示，與EDTA相比，玉米肽展示一個低的鐵離子螯合能力，這與Chen(1998)報道是一致的。Fe2+的清除能力與濃度呈強相關(guān)性，當(dāng)玉米肽1 mg/ml時，螯合能力10%，而當(dāng)玉米肽濃度為8 mg/ml時，螯合能力可達76.4%，與90 μg/ml EDTA螯合能力相當(dāng)。Fe2+清除能力很可能依賴于氨基酸的組成和氨基酸的序列。

3 結(jié)論

通過產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵玉米蛋白粉，極大地提高了玉米蛋白的可溶性，并測出其分子量降低且具有抗氧化活性肽的產(chǎn)生，理論上可以應(yīng)用于乳仔豬飼料中應(yīng)對氧化應(yīng)激，減少抗生素的使用。