■吳昌征 付大波 張 偉 羅文祥 周培源 郭 亮 楊 倩 周 櫻*

（1.上?？v和橫營養(yǎng)技術(shù)有限公司，上海200000；2.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢430000；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210000）

腸道是機(jī)體最大的消化和免疫器官，其結(jié)構(gòu)的完整性對動物生長和健康影響重大。益生菌可減少腸道炎癥，維持和恢復(fù)腸道屏障功能（楊桂連等，2015；李旌等，2017）；可緩解炎癥造成的腸道損傷程度，上調(diào)腸黏膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)，改善了腸道屏障功能（曹力等，2014；張俊等，2016）。微生態(tài)制劑可改善腸道菌群平衡、預(yù)防和治療疾病、促進(jìn)動物生長和飼料轉(zhuǎn)化率，可作為抗生素較理想的替代品（王秋菊等，2014），還具有減少環(huán)境污染和提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)，近年來在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛（徐晨希等，2017）。但是，微生態(tài)制劑如何通過改善腸道的通透性功能和緊密連接屏障功能來提高蛋雞的生產(chǎn)性能目前報道不是很多，因此本試驗(yàn)研究不同梯度微生態(tài)制劑對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和腸道屏障功能的影響，為微生態(tài)制劑的應(yīng)用和蛋雞腸道健康調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

微生態(tài)制劑由武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司提供，其主要成分為屎腸球菌、丁酸梭菌等。

41周齡健康海蘭灰蛋雞飼養(yǎng)于武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司團(tuán)風(fēng)養(yǎng)殖基地蛋雞舍內(nèi)。

試驗(yàn)日糧和營養(yǎng)水平參照美國NRC（1994）蛋雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制成全價粉狀料，飼料中未添加任何抗生素，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼料組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)動物及試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計，選取41周齡產(chǎn)蛋率相近，體重差異不顯著的健康海蘭灰蛋雞288只，按體重相近原則隨機(jī)分為4個處理組，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)12羽。分別在基礎(chǔ)日糧中添加0、25、50 g/t和100 g/t的微生態(tài)制劑。飼養(yǎng)試驗(yàn)為期10周，其中預(yù)試期2周，正試期8周，預(yù)試驗(yàn)期間，觀察蛋雞的產(chǎn)蛋率，并對各組進(jìn)行調(diào)整，使各組間產(chǎn)蛋率無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.3 試驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理

雞舍為三層層疊式籠養(yǎng)（3只/籠，4籠/重復(fù)），采用人工光照和自然光照相結(jié)合的方式，每天保持16 h光照（05:00～21:00），光照強(qiáng)度10～15 Lx，機(jī)械通風(fēng)+自然通風(fēng)，室溫15～20℃，濕度40%～60%。每天喂料三次（7:30、13:30、18:30），喂料量以每天基本不剩料為標(biāo)準(zhǔn)；并記錄這三個時間點(diǎn)舍內(nèi)溫濕度。每日10:00、16:30兩次撿蛋，撿蛋后分別進(jìn)行記數(shù)、標(biāo)記、存放。定期清理糞便，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫接種。整個試驗(yàn)期間自由采食和飲水。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能

記錄蛋重、產(chǎn)蛋個數(shù)、投料量、剩余料量、存欄雞數(shù)，計算平均蛋重、產(chǎn)蛋率（包括破損蛋）、平均日采食量、料蛋比（包括破損蛋）。每星期結(jié)算一次采食量。蛋重（g）：用電子天平稱量蛋重，精確到0.01 g。

平均產(chǎn)蛋率(%)=總產(chǎn)蛋數(shù)/(天數(shù)×雞數(shù))×100

平均蛋重(g)=總蛋重/蛋數(shù)

料蛋比=耗料量/蛋重

1.4.2 蛋品質(zhì)

1.4.2.1 蛋形指數(shù)

用游標(biāo)卡尺測量蛋的縱徑與最大橫徑，精確到0.01 mm。

蛋形指數(shù)=縱徑/橫徑

1.4.2.2 蛋殼相對重

蛋殼相對重(%)=蛋殼重/蛋重×100

1.4.2.3 含水量

將蛋清和蛋黃分離，分別稱重，放入恒溫干燥箱中50～53℃過夜，稱重。

1.4.2.4 蛋清、蛋黃中蛋白質(zhì)含量測定

將雞蛋打開完全分離蛋清液和蛋黃液，用微量移液器吸取分離后的液體至稱重過的消化管中，再次稱消化管的重量，用FOSS消化爐消化，用FOSS凱氏定氮儀定氮。

1.4.3 腸道通透性

于試驗(yàn)期8周斷料12 h，斷水2 h后，從各處理每重復(fù)中隨機(jī)選取1只進(jìn)行翅靜脈采血，3 500 r/min，4℃離心15 min，分離血清，迅速置于液氮內(nèi)，分裝，保存于-20℃冰箱，待測。

血清中的D-乳酸和二胺氧化酶用試劑盒（南京建成生物有限公司）檢測。D-乳酸采用終點(diǎn)顯色法檢測，二胺氧化酶采用速率法檢測。

1.4.4 緊密連接蛋白

取空腸中段，縱向剪開，用無菌玻片刮取黏膜，裝入經(jīng)DEPC處理過的EP管中，經(jīng)液氮預(yù)凍后，保存于-80℃冰箱內(nèi)，用于測定閉鎖蛋白（occludin）和閉鎖小帶蛋白1（zonulaoccludins-1，ZO-1）的mRNA相對表達(dá)量。

采用TRIzol試劑（Invitrogen Life Technologies）提取空腸組織中的總RNA。RNA的濃度和純度用分光光度計（NanoDrop 2000）進(jìn)行測定，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩２捎胵PCR方法測定occludin和ZO-1的基因表達(dá)。PCR引物序列見表2，由寶生物工程（大連）有限公司合成。qPCR的操作參照SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）[寶生物工程（大連）有限公司]的說明。qPCR在7500熒光定量儀（Applied Biosystems）上操作，PCR條件設(shè)置為95℃變性30 s，接著進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)由95℃變性5 s與60℃退火和延伸34 s構(gòu)成。以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT方法計算相對基因表達(dá)量。

表2 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析，以Duncan′s法做多重比較，以Curve Estimation做非線性回歸分析，以Pearson相關(guān)性分析對檢測指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對蛋雞生產(chǎn)性能的影響（見表3）

表3 微生態(tài)制劑對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

從表3中可以看出，與處理1相比，處理2、3、4蛋雞平均產(chǎn)蛋率分別提高了0.56%（P＞0.05）、1.67%（P＜0.05）和1.66%（P＜0.05），平均蛋重分別提高了0.27%、1.44%和1.46%，差異不顯著，與處理1相相比，處理3、4料蛋比均分別降低了0.54%（P＞0.05），差異不顯著。

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，平均產(chǎn)蛋率和平均蛋重與微生態(tài)制劑的水平呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，因此分別以平均產(chǎn)蛋率和平均蛋重為因變量（y），以添加微生態(tài)制劑水平為自變量（x），獲得相關(guān)回歸方程。

平均產(chǎn)蛋率與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=-0.000 2x2+0.040 2x+89.739（R2=0.933 2，N=6）；平均蛋重與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=-0.000 1x2+0.021 4x+59.534（R2=0.874，N=6）。

2.2 微生態(tài)制劑對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.2.1 微生態(tài)制劑對蛋形指數(shù)、蛋殼相對重、蛋清含水量、蛋黃含水量的影響（見表4）

表4 微生態(tài)制劑對蛋形指數(shù)、蛋殼相對重、蛋清含水量、蛋黃含水量的影響

從表4中可以看出，各處理組間蛋形指數(shù)無差異。與處理1相比，處理2、3和處理4蛋殼相對重均有提高趨勢，以處理3最高，比處理1提高4.33%，但差異不顯著（P＞0.05）。與處理1相比，處理2、3和處理4蛋清含水量分別降低1.97%（P＞0.05）、2.34%（P＜0.05）、2.41%（P＜0.05）。與處理1相比，處理2、3和處理4蛋黃含水量分別降低2.36%（P＞0.05）、5.27%（P＜0.05）、5.56%（P＜0.05）。

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，蛋殼相對重、蛋清含水量和蛋黃含水量與微生態(tài)制劑的水平呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，因此分別以蛋殼相對重、蛋清含水量和蛋黃含水量為因變量（y）,以添加微生態(tài)制劑水平為自變量（x）獲得相關(guān)回歸方程。

蛋殼相對重與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=-0.000 1x2+0.012 8x+8.963 2（R2=0.760 7，N=6）；蛋清含水量與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=0.000 5x2-0.065 6x+86.636（R2=0.960 3，N=6）；蛋黃含水量與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=0.000 4x2-0.073 1x+50.61（R2=0.977 5，N=6）。

2.2.2 微生態(tài)制劑對蛋清中蛋白質(zhì)含量、蛋黃中蛋白質(zhì)含量的影響（見表5）

表5 微生態(tài)制劑對蛋清中蛋白質(zhì)含量、蛋黃中蛋白質(zhì)含量的影響(%)

從表5中可以看出，與處理1相比，處理2、3和處理4蛋清中蛋白質(zhì)含量分別提高4.72%（P＞0.05）、8.99%（P＜0.05）、8.45%（P＜0.05）。與處理1相比，處理2、3和處理4蛋黃中蛋白質(zhì)含量分別提高0.87%（P＞0.05）、4.45%（P＜0.05）、3.52%（P＞0.05）。

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，蛋清中蛋白質(zhì)含量和蛋黃中蛋白質(zhì)含量與微生態(tài)制劑的水平呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，因此分別以蛋清中蛋白質(zhì)含量和蛋黃中蛋白質(zhì)含量為因變量（y）,以添加微生態(tài)制劑水平為自變量（x）獲得相關(guān)回歸方程。

蛋清中蛋白質(zhì)含量與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=-0.000 2x2+0.029 1x+10.984（R2=0.988 5，N=6）；蛋黃中蛋白質(zhì)含量與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=-0.000 1x2+0.019 1x+16.112（R2=0.816 4，N=6）。

2.3 微生態(tài)制劑對蛋雞血清D-乳酸和二胺氧化酶的影響（見表6）

表6 微生態(tài)制劑對血清D-乳酸和二胺氧化酶的影響

從表6中可以看出，與處理1相比，處理2、3和處理4血清D-乳酸含量分別降低9.51（P＞0.05）、20.11（P＜0.05）和18.28（P＜0.05）。與處理1相比，處理2、3和處理4血清二胺氧化酶含量分別降低4.68（P＞0.05）、11.87（P＜0.05）和9.95（P＞0.05）。

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，D-乳酸和二胺氧化酶與微生態(tài)制劑的水平呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，因此分別以D-乳酸和二胺氧化酶為因變量（y）,以添加微生態(tài)制劑水平為自變量（x）獲得相關(guān)回歸方程。

D-乳酸與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=0.000 2x2-0.031 9x+5.507 1（R2=0.975 9，N=6）；二胺氧化酶與添加微生態(tài)制劑水平呈現(xiàn)出二次項(xiàng)方程：y=0.000 2x2-0.028 5x+8.393 7（R2=0.941 6，N=6）。

2.4 微生態(tài)制劑對蛋雞空腸緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平的影響（見表7）

從表7中可以看出，與處理1相比，處理2、3和處理4空腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），且表達(dá)量隨著添加梯度的增加而依次增加。

表7 微生態(tài)制劑對蛋雞空腸緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平的影響

2.5 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析指變量之間存在一定的客觀規(guī)律，但數(shù)量上不是嚴(yán)格對應(yīng)的依存關(guān)系（孫娟等，2016）。通過相關(guān)性分析可大體反映出指標(biāo)之間相互頡頏或協(xié)同關(guān)系，若指標(biāo)間存在顯著或極顯著正相關(guān)，則表明存在協(xié)同作用（翁城武等，2017）。

2.5.1 生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)與血清D-乳酸和二胺氧化酶相關(guān)性分析（見表8）

表8 蛋品質(zhì)與血清D-乳酸和二胺氧化酶相關(guān)性分析

從表8中可以看出，D-乳酸和二胺氧化酶與蛋黃含水量極呈顯著和顯著正相關(guān)。D-乳酸和二胺氧化酶分別與料蛋比和蛋清含水量存在正相關(guān)趨勢。表明D-乳酸、二胺氧化酶與生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)的交互作用以協(xié)同作用為主。

2.5.2 生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)指標(biāo)與緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平相關(guān)性分析（見表9）

表9 生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)指標(biāo)與緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平相關(guān)性分析

從表9中可以看出，occludin與產(chǎn)蛋率極顯著正相關(guān)，與蛋重、蛋清中蛋白含量和蛋黃中蛋白含量顯著正相關(guān)。ZO-1與產(chǎn)蛋率極顯著正相關(guān)，與蛋重、蛋清中蛋白含量和蛋黃中蛋白含量顯著正相關(guān)。表明緊密連接相關(guān)蛋白與生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)的交互作用以協(xié)同作用為主。

3 討論

D-乳酸和二胺氧化酶可作為胃腸黏膜受損程度和恢復(fù)狀況的診斷指標(biāo)（張妮等，2006；聶海等，2017）。D-乳酸是腸道固有細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，哺乳動物不能產(chǎn)生、也沒有代謝D-乳酸的酶。腸黏膜損害時，血液中D-乳酸濃度增加（Murray等，1994）。二胺氧化酶是一種小腸黏膜酶，能控制腸黏膜增殖，在血清中含量極低，腸黏膜細(xì)胞損傷后，進(jìn)入血清中，可作為評價胃腸道黏膜損傷后黏膜細(xì)胞成熟和完整性的指標(biāo)（蘇璇等，2014；Thompson等，1987）。二胺氧化酶活性隨著仔豬小腸黏膜損傷程度的加重而增加（胡泉舟等，2007）。雞血液中D-乳酸含量隨內(nèi)毒素含量增加而增高，隨內(nèi)毒素含量減少而降低，而內(nèi)毒素可導(dǎo)致腸黏膜通透性的增加（黃啟亮等，2015）。益生菌可降低血清D-乳酸和二胺氧化酶水平，修復(fù)損傷腸黏膜，降低腸黏膜通透性，促進(jìn)腸道屏障功能恢復(fù)（馬麗濱等，2014；韓玉萍等，2017）。丁酸可改善腸道結(jié)構(gòu)、刺激胰酶分泌，乙酸、丙酸可刺激腸道蠕動，改善腸道環(huán)境，而這三種短鏈脂肪酸是丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物（Ho等，2011）。益生菌可降低患者D-乳酸和二胺氧化酶水平，降低患者腸道黏膜通透性，減輕了腸源性內(nèi)毒素血癥，促進(jìn)腸道黏膜功能恢復(fù)（江巧麗等，2016；蔣歡等，2015）。與抗生素組和大腸桿菌攻毒組相比，丁酸梭菌可降低肉雞血清二胺氧化酶的含量7.5%和17.75%，同時細(xì)菌易位的發(fā)生率也降低了，促進(jìn)了腸道屏障功能的修復(fù)（周琳，2012）。本試驗(yàn)中，不同添加量微生態(tài)制劑可降低血清D-乳酸和血清二胺氧化酶水平，與上述報道一致。

跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白是腸上皮細(xì)胞的緊密連接的主要組成部分，閉鎖蛋白（occludin）是一種跨膜蛋白，閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）是常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白之一，occludin家族可與ZO-1共同構(gòu)成緊密連接復(fù)合物；給予干預(yù)治療，可上調(diào)炎癥性腸病、腹瀉等誘導(dǎo)的occludin和ZO-1表達(dá)下降，減小腸黏膜通透性，在一定程度上恢復(fù)腸道屏障功能，因此occludin和ZO-1通常作為評價機(jī)體緊密連接通透性和屏障功能的指標(biāo)（王海燕等，2012；甘元濤等，2016；Visser等，2009）。冷應(yīng)激通過降低occludin mRNA表達(dá)量增加雛雞腸黏膜通透性，大豆抗原蛋白的主要致敏原β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白通過降低ZO-1 mRNA的相對表達(dá)量，損傷了腸道緊密連接（張雯，2010；曹程鳴等，2017）。益生菌提高了occludin表達(dá)，維持了腸上皮緊密連接，從而保護(hù)腸黏膜屏障、減少細(xì)菌易位（沈通一，2004）。益生菌可上調(diào)occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)量，修復(fù)侵襲性大腸桿菌感染破壞的腸道完整性（張中偉等，2007）。益生菌可通過維持腸道菌群平衡，增加occludin的表達(dá)，改善腸道上皮的機(jī)械屏障，治療結(jié)腸炎（張文遠(yuǎn)等，2010）。益生菌或者合生素（益生菌+纖維寡糖）可上調(diào)occludin和ZO-1蛋白表達(dá)量，改善熱應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞生產(chǎn)性能下降和腸道屏障功能受損（宋娟，2014）。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，不同梯度的微生態(tài)制劑可不同程度的提高occludin和ZO-1的表達(dá)量，說明微生態(tài)制劑對腸道屏障保護(hù)功能涉及到緊密連接。

腸道的屏障功能對動物機(jī)體至關(guān)重要，完整的、良好的腸黏膜可避免細(xì)菌、毒素和日糧抗原向黏膜下的組織或機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的滲透（馬改彥等，2017）。益生菌可顯著減低仔豬血清內(nèi)毒素和D-乳酸含量，降低腸黏膜通透性，減少了腹瀉率，保證了仔豬生產(chǎn)性能（龐敏，2016）。微生態(tài)制劑（如丁酸梭菌、屎腸球菌等）及其產(chǎn)物[維生素、酶（蛋白酶、纖維素酶）、短鏈脂肪酸等]可通過改善腸道屏障完整性的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子——腸道共生菌平衡，提高畜禽腸道屏障功能，促進(jìn)機(jī)體對飼料（如飼料代謝能、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分和微量元素鈣、鐵等）的消化利用率，顯著提高動物生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)（邱權(quán)等，2016；Hugas等，2003；Tuomola等，1998；Hooper等，2001；張建云，2012）。李育苗（2017）認(rèn)為微生態(tài)制劑及其產(chǎn)物可減少腸內(nèi)蛋白向氨或胺的轉(zhuǎn)化，增加其向雞蛋中蛋白轉(zhuǎn)化，從而提升蛋品質(zhì)。丁酸梭菌上調(diào)腸上皮緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平，改善了斷奶仔豬腸黏膜屏障功能，提高了仔豬的生長性能（李玉鵬等，2017）。益生菌顯著降低了蛋雞血清中D-乳酸和二胺氧化酶活性，顯著增加了腸黏膜occludin和ZO-1 mRNA表達(dá)量，減少了內(nèi)毒素對腸結(jié)構(gòu)的破壞，從而改善了蛋雞對飼料的消化利用，其生產(chǎn)性能得到提高（雷凱，2015）。由此可推測，微生態(tài)制劑通過改善腸道通透性和腸道緊密連接，提高了蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高了雞蛋中營養(yǎng)成分含量和蛋雞生產(chǎn)性能。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)條件下，不同添加量微生態(tài)制劑可降低腸道黏膜通透性，上調(diào)緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量，提高小腸屏障功能，獲得良好的蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)。