劉 濤, 鄭 燕, 楊 丹， 曹 鑫, 楊俊莉, 張 佳, 徐玉玲

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1].研究表明，金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱、保肝、降血脂及抗化免疫調節(jié)等作用[2].山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1].研究發(fā)現，山銀花具有抑菌、抗病毒、抗過敏和肝臟保護等作用[3].

《中國藥典》自2005年版起將金銀花和山銀花分為兩個品種收載.在南方大部分地區(qū)，民間仍然習慣將山銀花稱為金銀花.在藥材市場，山銀花常被用來替代金銀花入藥，但《中國藥典》2015版規(guī)定，只有忍冬為金銀花的惟一合法來源.針對金銀花與山銀花中的差異，科研人員進行了相關的研究，取得了一系列成果[4-6].在此基礎上，本研究通過建立金銀花與山銀花的紫外—可見與紅外指紋圖譜，在不同波長下對二者成分及其官能團進行分析，完善了金銀花與山銀花質量控制差異的研究方法.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用的材料包括：無水乙醇(批號，2016102401)、石油醚(批號，2016091301)、甲醇(批號，2017010501)，均購自成都科龍化工試劑廠，溴化鉀(批號，20170526)，購自天津卒越化學品有限公司；水為藍光純凈水；金銀花、山銀花藥材購置于不同中藥店，經四川省中醫(yī)藥科學院李青苗副研究員鑒定，藥材金銀花為忍冬，藥材山銀花為灰氈毛忍冬，樣品來源分別見表1、2.

表1 金銀花藥材來源

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：TU-1810PC型紫外—可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Spectrum Tow型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；FW-5型壓片機(天津博天勝達科技發(fā)展有限公司)；LD510-2R型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；HS-3120型超聲清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司).

表2 山銀花藥材來源

2 方法與結果

2.1 紫外—可見指紋圖譜

2.1.1 供試品溶液制備.

取金銀花、山銀花粉末各約0.6 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得.

2.1.2 測試條件.

以甲醇調整基線并作為參比液進行紫外—可見光譜測定，設定掃描波長為200～900 nm，掃描速度 200 nm/min，狹縫寬1.5 nm，采樣間隔2 nm.

2.1.3 方法學考察.

按“2.1.1"項下方法制備金銀花供試品溶液1份，取供試品溶液，利用波長為200～900 nm的光譜進行全波長掃描，得到圖譜后，用樣品的吸收波長計算平均相對標準偏差RSD，測得精密度、穩(wěn)定性、重復性考察項下紫外—可見圖譜波長在329 nm、265 nm、242 nm、230 nm、217 nm處的RSD均小于5.0%.結果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性均良好.

2.1.4 金銀花與山銀花紫外—可見光譜采集.

分別取10批金銀花藥材粉末與10批山銀花藥材粉末，按照“2.1.1"項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.2"項下條件測定.10批金銀花藥材疊加圖譜見圖1，10批山銀花藥材疊加圖譜見圖2.

2.1.5 金銀花對照紫外—可見指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中進行構建指紋圖譜的10批金銀花樣品(編號，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10)，以其吸收波長下，吸光度的平均值為對照指紋圖譜的吸收強度，得到對照紫外—可見圖譜如圖3所示.

圖1 10批金銀花紫外—可見光譜疊加圖

圖2 10批山銀花紫外—可見光譜疊加圖

圖3金銀花對照紫外—可見指紋圖譜

2.1.6 樣品指紋圖譜相似度分析.

將山銀花樣品的紫外—可見圖譜與得到的對照紫外—可見指紋圖譜進行相似度分析，采用相關系數法[7-8]進行計算，結果見表3.

表3 相似度分析結果

由表3可知，山銀花指紋圖譜與金銀花對照指紋圖譜的相似度在96.4%～98.7%范圍內.此表明，金銀花藥材與山銀花藥材的內在質量有較高的相似性.

2.1.7 結果分析.

由圖1、圖2可以觀察到，金銀花的吸光度范圍大致在0.214～1.098之間，山銀花的吸光度范圍大致在0.150～1.400之間，并且金銀花與山銀花在波長329 nm處都有一波峰，在波長265 nm處都有一波谷，金銀花在波長230 nm、242 nm處有一波峰，山銀花在這兩處峰形不太明顯，但兩藥材在波長217 nm處都有一波峰.

研究證實，在波長329 nm處有特征吸收峰的是亞異丙基丙酮類化合物，在波長230 nm處有特征吸收峰的是芳香族化合物，在波長242 nm處有特征吸收波峰的是甾體類化合物，在波長217 nm處有特征吸收峰的是1,3-己二烯類化合物.此表明，金銀花與山銀花都含有亞異丙基丙酮類化合物和1,3-己二烯類化合物；金銀花含有甾體類化合物和芳香族化合物，但山銀花可能含有少量或不含有.

2.2 紅外指紋圖譜

首先測定金銀花、山銀花藥材粉末紅外指紋圖譜，再以不同極性的甲醇、水、石油醚為溶媒制備供試品溶液，再測定其紅外指紋圖譜，目的是排除不同極性溶媒對圖譜產生的影響.由于紫外—可見指紋圖譜供試品制備以甲醇為溶媒，最后選擇以甲醇為溶媒的金銀花與山銀花紅外指紋圖譜進行共有峰率及變異峰率的分析，目的是排除溶媒對兩種分析方法產生的影響.

2.2.1 金銀花與山銀花粉末紅外圖譜采集.

分別取適量金銀花、山銀花藥材粉末于瑪瑙乳缽中，加入100 mg溴化鉀粉末研磨均勻，取適量研細后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測定紅外光譜，測定區(qū)域為450～4 000 cm-1.

2.2.2 3種提取溶媒下供試品紅外圖譜采集.

取金銀花、山銀花粉末各約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別平行3份，分別精密加入石油醚、甲醇、水25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用相應的溶媒補足減失的質量，搖勻，濾過，制得供試品溶液.取20 μL供試品溶液于瑪瑙乳缽中，揮干，加入100 mg 溴化鉀粉末研磨均勻，取適量研細后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測定紅外光譜，測定區(qū)域為450～4 000 cm-1.

2.2.3 方法學考察.

取金銀花樣品(批號，170319)4份，按照“2.2.1"及“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并進行測定，取所得圖譜中吸收強度最強的6個對應波數作為特征吸收波數.經考察，測得精密度、重復性、穩(wěn)定性項下各特征峰波數值RSD均小于1.5%.結果表明，方法的精密度、重復性及穩(wěn)定性均符合要求.

2.2.4 金銀花與山銀花紅外圖譜采集及數據分析.

將10批金銀花與山銀花藥材粉末按“2.2.1”及“2.2.2”項下方法進行測定，得到不同的金銀花與山銀花紅外指紋圖譜如圖4所示.

cm-1

圖4不同處理方法下金銀花與山銀花紅外光譜疊加圖

圖4中，10批金銀花與山銀花藥材直接壓片的紅外光譜疊加圖譜，見圖4(H1)、(H2)；石油醚為提取溶媒的10批金銀花與山銀花藥材紅外光譜疊加圖譜，見圖4(H3)、(H4)；甲醇為提取溶媒10批金銀花與山銀花藥材的紅外光譜疊加圖譜，見圖4(H5)、(H6)；水為提取溶媒10批金銀花與山銀花藥材的紅外光譜疊加圖譜，見圖4(H7)、(H8).

由圖4可知：在1 700～700 cm-1指紋區(qū)，藥材粉末直接壓片光譜的吸收峰強度強于溶劑提取物，石油醚提取物吸收峰強度弱于甲醇與水提取物；在3 700～3 000 cm-1指紋區(qū)，石油醚提取物吸收峰強度弱于甲醇與水提取物，甲醇與水提取物吸收峰強度較弱于藥材粉末直接壓片；金銀花與山銀花的不同極性提取物圖譜基本相似.產生以上結果的原因可能是由于3種溶媒極性差異所致，石油醚極性較弱，提取效率較低，甲醇與水極性較強，但較藥材粉末直接壓片，存在較大差異，表明甲醇與水不能將藥材中有效成分提取完全.在紅外光譜中，不同溶媒提取的金銀花與山銀花藥材無明顯差異，此表明，不同溶媒提取的金銀花與山銀花有效成分基本相似.

由圖4(H1)～(H8)可見，在3 400 cm-1、2 900 cm-1、1 600 cm-1、1 000 cm-1、2 000 cm-1區(qū)域附近都存在波谷，在1 500 cm-1、1 200 cm-1、880 cm-1域附近都存在波峰，且金銀花紅外指紋圖譜與山銀花紅外指紋圖譜存在的波峰波谷基本相似，此表明金銀花藥材與山銀花藥材內在質量基本相似.經查閱資料，金銀花中主要的成分是綠原酸、木犀草苷.綠原酸屬于酚酸類，而木犀草苷屬于黃酮類，根據其結構式的官能團-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，可以把其紅外光譜圖分為3 400～2 800 cm-1、1 800～1 100 cm-1、1 100～450 cm-13個區(qū)段來研究[9].據圖4(H1)～(H8)可知，在金銀花與山銀花藥材中，都含有-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，且成分與含量沒有明顯差異.

2.2.5 甲醇為提取溶媒的金銀花與山銀花藥材紅外指紋圖譜數據分析.

共有峰定義為在相互比較的2個紅外指紋圖譜中都出現的一組吸收峰，且組內吸收峰的最大波數差顯著小于其與相鄰組之間的平均波數差，反之則為變異峰.共有峰率和變異峰率[10]的表達式為，

Na=Ng+na，Nb=Ng+nb，

式中，Na為指紋圖譜a的總峰數；Nb為指紋圖譜b的總峰數；na為紅外指紋圖譜a的變異峰數；nb為紅外指紋圖譜b的變異峰數；Ng為共有峰數；P為共有峰率；Nd為獨立峰數；Pva為指紋圖譜a的變異峰率；Pvb為指紋圖譜b的變異峰率.

5批金銀花樣品基本關系組與對如下：

(1)R1∶r1 (25.0,162.5,237.5)，R1∶r2(23.5,150.0,275.0)，R1∶r3(30.4,200.0,128.6)，R1∶r4(18.8,133.3,400.0)，R1∶r5(32.0,100.0,212.5)

(2)R2∶r1(50.0,30.0,170.0)，R2∶r2(36.0,44.4,233.3)，R2∶r3(64.3,44.4,111.1)，R2∶r4(40.6,0,246.2)，R2∶r5(40.9,44.4,200.0)

(3)R3∶r1(55.6,20.0,160.0)，R3∶r2(30.8,50.0,275.0)，R3∶r3(81.8,33.3,88.9)，R3∶r4(31.4,9.1,309.1)，R3∶r5(52.6,20.0,170.0)

(4)R4∶r1(210.0,19.0,28.6)，R4∶r2(65.2,60.0,93.3)，R4∶r3(75.0,100.0,33.3)，R4∶r4(77.8,14.2,114.3)，R4∶r5(94.0，41.2,64.7)

(5)R5∶r1(38.5,90.0,170.0)，R5∶r2(100.0,12.5,87.5)，R5∶r3(66.7,80.0,70.0)，R5∶r4(58.6,5.9,164.7)，R5∶r5(60.0,50.0,166.7).

其中，R1∶r1(25.0,162.5,237.5)，R1與r1的共有峰率為25.0%，R1相對于r1的變異峰率為162.5%，即金銀花變異峰率為162.5%，r1相對于R1的變異峰率為237.5%，即山銀花變導峰率為237.5%.

在(1)組中，上述試驗結果表明，金銀花樣品R1與山銀花r1～r5的相似度較低，共有峰均小于35%，且每組數據中金銀花變異峰率與山銀花變異峰率均大于共有峰率，表明金銀花樣品R1與山銀花樣品r1～r5的內在質量差異較大；第(2)組與第(3)組共有峰最大值為81.8%，每組數據中金銀花與山銀花變異峰率至少一項大于共有峰率.表明金銀花樣品R2、R3與山銀花樣品r1～r5的內在質量差異較大；在第(4)組與第(5)組中，除R4∶r1組與R5∶r2組共有峰率大于100.0%外，其余每組數據中金銀花與山銀花變異峰率至少一項大于共有峰率.表明金銀花樣品R4、R5與山銀花樣品r1～r5的內在質量存在差異，但較金銀花樣品R1～R3與山銀花樣品r1～r5的內在質量差異小.

通過計算5批金銀花與山銀花藥材的共有峰率與變異峰率發(fā)現，不同批號金銀花藥材與山銀花藥材的共有峰率與變異峰率大小不一.數據(1)～(3)組的分析結果表明，金銀花藥材R1～R3與山銀花藥材r1～r5的內在質量存在較大差異；數據(4)～(5)組的分析結果表明，金銀花藥材R4、R5與山銀花藥材r1～r5的內在質量存在差異，但內在質量差異較金銀花藥材R1～R3與山銀花藥材r1～r5小.可以認為，金銀花、山銀花藥材的質量差異來源于金銀花與山銀花藥材自身存在的差異.因此，以化學成分或單個波長下的指紋圖譜比較金銀花和山銀花的差異應該考慮藥材自身的差異對實驗結果造成的影響，而目前已有的研究文獻缺少對這方面的分析.

3 結 論

本研究通過構建金銀花與山銀花樣品紫外—可見指紋圖譜發(fā)現，金銀花藥材與山銀花藥材的內在質量基本相似.紅外光譜分析表明，金銀花藥材與山銀花藥材的內在質量存在一定差異.本研究認為，目前金銀花與山銀花藥材的質量控制仍不夠完善，在臨床用藥時，應加強對兩者的相關檢控.同時，本研究所用方法可為其他種屬相近的中藥材之間的對比研究提供新的思路.