閆志強，鄭 華，朱買勛，付文貴，張邑帆，翟少欽

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

免疫系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫應答及免疫功能的重要系統(tǒng)，具有識別和排除抗原性異物、與機體其他系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)共同維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡的功能，由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成[1]。脾作為機體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，其中T淋巴細胞直接參與細胞免疫，并對外周血中T細胞亞群的分布有重要調(diào)節(jié)作用；巨噬細胞可作為抗原提呈細胞，調(diào)節(jié)和增強免疫應答。因此，脾組織結構及細胞周期的完整性是行使其免疫功能的基礎?，F(xiàn)代研究表明，一定劑量的環(huán)磷酰胺可顯著抑制免疫器官生長，抑制非特異性和特異性淋巴細胞分化，對機體免疫系統(tǒng)有一定損害，因此，被廣泛應用于建立動物免疫抑制模型[2]。女黃顆粒是基于中獸醫(yī)理論對免疫低下疾病的認識，結合中藥理論組的中藥復方，主要用于調(diào)節(jié)禽的免疫功能。本研究主要利用環(huán)磷酰胺復制小鼠免疫抑制模型，并使用女黃顆粒對其進行治療，以考察女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾組織病理學及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康昆明小鼠50只，體重(17.0±2.0)g[中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號SCXK-(軍)2012-0011]。

1.2 試驗藥物

女黃顆粒中女貞子、黃芪、枸杞子和菟絲子，其比例為4∶4∶1∶1，藥材均購于重慶榮昌區(qū)桐君閣大藥房，所有中藥經(jīng)過提取后，濕法制粒，制成規(guī)格為1.0 g顆粒中含原生藥1.0 g，經(jīng)重慶市獸藥飼料檢測所測定特女貞苷含量為1.46 mg·g-1。注射用環(huán)磷酰胺購自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號17020525。

1.3 主要儀器

RM2235石蠟切片機(Leica，德國)，CX21FS1光學顯微鏡(OLMPUS，日本)，DM1000顯微成像系統(tǒng)(Leica，德國)，流式細胞儀(BECKMAN COULTER，CytoFLEX)。

1.4 小鼠免疫抑制模型的復制

參照文獻[3]，使用注射用環(huán)磷酰胺(用生理鹽水稀釋)，以80 mg·kg-1劑量腹腔注射，1次·d-1，連續(xù)5 d。

1.5 試驗分組及處理

動物適應性飼養(yǎng)3 d后，將50只健康昆明小鼠隨機分為空白組、模型組和女黃顆粒高、中、低劑量組(用水將女黃顆粒溶解成1.0 g·mL-1，然后按照需要進行稀釋)，共計5組，每組10只，自由采食和飲水。除空白組外，其余4組按照“1.4”方法進行造模，造模結束后，空白組和模型組灌胃生理鹽水，3個女黃顆粒組分別按0.5、1.0、1.5 g·kg-1劑量灌胃給藥，1次·d-1，連續(xù)7 d。

1.6 脾指數(shù)的測定

在末次給藥后次日，將小鼠進行乙醚麻醉后脫臼處死，稱其體重，無菌取脾，并稱其質量，按公式計算脾指數(shù)。脾指數(shù)=脾質量(mg)/體重(g)。

1.7 血液學指標的測定

動物處死前，小鼠眼眶后靜脈叢采血入EDTA-K2抗凝管。采用全血細胞分析儀檢測。檢測內(nèi)容包括紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、淋巴細胞百分比和單核細胞百分比。

1.8 脾組織切片制作

4%多聚甲醛固定的組織樣本，經(jīng)流水沖洗30 min，進行組織修塊，放入病理包埋塑料筐中脫水，二甲苯透明，浸蠟3 h，包埋組織塊于石蠟中。將包埋好的組織切成5 μm厚的薄片，展平放在載玻片上60 ℃烘烤2 h后用二甲苯脫蠟，流水洗滌20 min，蘇木素染色30 min，流水洗滌20 min，伊紅染色5 min，再經(jīng)脫水、透明后用樹脂膠封片。最后顯微鏡下觀察組織病理學變化，采用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄組織學損傷。

1.9 脾細胞周期檢測

取下小鼠脾組織，經(jīng)機械法剪碎后300目濾布過濾，制成脾細胞懸液，離心，用PBS液調(diào)節(jié)細胞濃度至106個·mL-1。取1 mL細胞懸液于流式管中，加入1 mL的Triton(0.02%)，4 ℃處理8 min，離心棄上清，加入PI染色液5 μL漩渦混勻，4 ℃染色 30 min，加入1 mL PBS于流式管中，離心棄上清。再加入450 μL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀進行數(shù)據(jù)采集并用ModFit軟件進行數(shù)據(jù)結果分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾指數(shù)的影響

如表1所示，與空白組相比，模型組脾指數(shù)顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，女黃顆粒低、中、高劑量組脾指數(shù)極顯著升高(P<0.01)。

組別Group劑量/(g·kg-1)Dosage脾指數(shù)/(mg·g-1)Spleen index空白組Control group—5.68±0.21ABb模型組Model group—3.48±0.15Bc低劑量組Low-dose group0.56.29±0.88Aab中劑量組Mid-dose group1.06.67±0.83Aab高劑量組Hig-dose group1.57.80±0.46Aa

同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母或無字母肩標表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Means in a column with different letters are different, the capital letters meanP<0.01, the small letters meanP<0.05, and there is no difference (P>0.05) for means in a row without letter or with the same letter. The same as below

2.2 女黃顆粒對免疫抑制小鼠血液學指標的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組白細胞數(shù)、淋巴細胞百分比及單核細胞百分比極顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，女黃顆粒高、中、低劑量組淋巴細胞百分比、單核細胞百分比極顯著升高(P<0.01)。紅細胞數(shù)無顯著變化。

2.3 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾組織病理學的影響

如圖1脾組織切片所示：空白組小鼠脾組織形態(tài)結構均正常，白髓區(qū)界限較清晰，白髓區(qū)的淋巴細胞排列致密，淋巴濾泡結構清晰可見；紅髓區(qū)富含充有紅細胞的血竇。模型組脾組織紅髓和白髓分界不清，白髓區(qū)和紅髓區(qū)的淋巴細胞數(shù)量均明顯減少。女黃顆粒低劑量組脾組織白髓區(qū)淋巴細胞數(shù)量未見明顯減少，巨噬細胞數(shù)量較空白組多，紅髓區(qū)有明顯的淤血。女黃顆粒中劑量組脾組織紅髓和白髓界限分明，白髓內(nèi)淋巴細胞較為密集，未見有明顯的病理學損傷。女黃顆粒高劑量組脾組織紅髓區(qū)輕度淤血，局部形成較大的空腔，其內(nèi)有多量細胞核碎片。

2.4 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾細胞周期的影響

由表3可知：空白組脾細胞主要處于G0/G1期；經(jīng)過環(huán)磷酰胺刺激后，與空白組比較，模型組處于G0/G1期的脾細胞比率極顯著下降(P<0.01)，處于S期的脾細胞比率極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，女黃顆粒組G0/G1期脾細胞升高，S期脾細胞比率降低，其中女黃顆粒中劑量組差異均極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾指數(shù)的影響

脾是免疫細胞定居的場所，能合成補體、干擾素等生物活性物質，同時可清除血液中的病原體、衰老死亡的血細胞及免疫復合物等[4-6]。一般認為，免疫器官質量增加是由于其自身細胞生長發(fā)育和分裂增殖所致，是免疫增強的表現(xiàn)，免疫器官質量的降低為免疫抑制所致，表明機體免疫狀況變差[7-8]。本試驗結果顯示，注射環(huán)磷酰胺后小鼠脾指數(shù)降低，可能是環(huán)磷酰胺抑制了脾的生長發(fā)育，給藥后，脾指數(shù)升高，迅速恢復并出現(xiàn)“反跳”現(xiàn)象[9]，推測女黃顆粒中含有大量氨基酸、多糖等脾生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質，促進脾生長，并能解除環(huán)磷酰胺對脾的抑制作用，增強機體免疫功能。

3.2 女黃顆粒對免疫抑制小鼠血液學指標的影響

淋巴細胞是由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應答功能的重要細胞成分。脾作為機體最大的淋巴器官產(chǎn)生大量淋巴細胞進入血液，因此血液中淋巴細胞數(shù)間接反映脾的功能。血液學指標檢測結果表明：注射環(huán)磷酰胺后，與免疫有關的白細胞數(shù)、淋巴細胞百分比及單核細胞百分比降低明顯，腹腔注射環(huán)磷酰胺成功復制免疫抑制模型。給藥后，小鼠白細胞數(shù)、淋巴細胞百分比及單核細胞百分比均有不同程度的升高，接近空白組水平。女黃顆粒中枸杞、女貞子、菟絲子具有補益肝腎的功能，黃芪健脾益氣，諸藥合用有健脾補腎功效，可調(diào)節(jié)血液白細胞數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，健脾補腎方對白細胞減少癥有較好的療效，本研究結果與文獻報道一致[10]。

組別Group白細胞數(shù)/(×109·L-1)WBC淋巴細胞百分比/%LYM單核細胞百分比/%MON紅細胞數(shù)/(×1012·L-1)RBC空白組Control group4.59±0.99Aa74.27±3.39Aa5.62±0.66Aa9.23±1.37模型組Model group2.38±0.31Bb41.00±4.10Dd3.08±0.61Cc9.20±0.57低劑量組Low-dose group3.77±0.77ABa50.00±5.85Cc4.34±0.69Bb9.01±0.75中劑量組Mid-dose group3.83±0.87ABa62.00±4.16Bb4.81±0.74ABb9.72±0.80高劑量組Hig-dose group3.95±0.99Ab64.23±6.17Bb4.62±0.41ABb9.73±0.97

圖1 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾組織學結構的影響(HE染色，400×)Fig.1 Effect of Nühuang granules on spleen histopathology of immunosuppressive mice (HE staining, 400×)

表3 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾細胞周期的影響

3.3 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾組織病理學的影響

病理學檢查可以從不同水平上反映臟器、組織的健康狀態(tài)。本試驗組織病理學檢查結果表明，給藥女黃顆粒后，低、中劑量組脾組織有不同程度的恢復，組織結構變清晰，淋巴細胞數(shù)量增多，以中劑量組效果最好。據(jù)文獻報道，中藥多糖對受損傷的免疫器官有較好的保護和調(diào)節(jié)作用[11]，而女黃顆粒中黃芪、枸杞、女貞子中含有大量多糖，可能是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要成分。

3.4 女黃顆粒對免疫抑制小鼠脾細胞周期的影響

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段[12-13]。細胞間期包括G1期、S期、G2期。G1期又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。G2期為DNA合成后期,在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質[14]。G0期的細胞停止細胞分裂，去執(zhí)行一定生物學功能。本研究結果表明：空白組大部分脾細胞處于G0/G1期，執(zhí)行生物學功能。模型組在造模后到試驗結束時，處于G0/G1期的脾細胞百分比降低，表明脾細胞執(zhí)行生物學功能能力減弱，免疫功能下降；同時S期脾細胞百分比顯著升高，推測此時期為脾的自我修復期。給藥后，G0/G1期的脾細胞百分比增多，S期脾細胞百分比降低，表明女黃顆粒能促進脾修復，并通過增加G0/G1期脾細胞增強其免疫作用；同時G2期的脾細胞百分比增多，推測女黃顆?？赏ㄟ^增加G2/M期的脾細胞，增加脾的免疫性，使脾增重，說明女黃顆?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)細胞周期的進程來改善免疫功能。

4 結 論

女黃顆?？梢蕴岣呙庖咭种菩∈蟮钠⒅笖?shù)、增加白細胞數(shù)、淋巴細胞百分比及改善受損的脾組織結構。