龐 敏，朱兆榮,2，喬芊芊，詹珠玉，劉 娟,2*

(1. 西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460； 2. 重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新研發(fā)實驗室，重慶 402460)

術(shù)芩是根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床辨證論治原則，選用白術(shù)、黃芩、黃芪、茯苓等組成的自擬中藥復(fù)方。前期研究表明術(shù)芩顆粒對冬季仔豬腹瀉有明顯的治療作用和增強免疫功能的作用[1-2]。術(shù)芩復(fù)方中的白術(shù)、黃芪、茯苓等主要活性物質(zhì)為多糖類物質(zhì)[3-5]。多糖是具有多種生物活性的天然大分子物質(zhì)，廣泛存在于中藥材中，是中藥材中發(fā)揮獨特療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，被稱為天然的免疫調(diào)節(jié)劑[5]。

脾是重要的外周免疫器官，是淋巴細(xì)胞定居的場所。自噬參與淋巴細(xì)胞的發(fā)育、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答途徑。自噬(autophagy)，也稱為自我吞噬(self-eating)，在1962年由Ashford和Porter[6]首先提出，他們將所觀察到的細(xì)胞中存在的自食現(xiàn)象稱為自噬。自噬在維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進細(xì)胞生存、生長、發(fā)育以及抵御外來病原微生物等方面起著重要作用[7-9]。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種動態(tài)降解的過程，適當(dāng)?shù)淖允煽纱龠M各種應(yīng)激下的細(xì)胞存活[10]。然而，過度或持續(xù)的自噬可以降低細(xì)胞活力并引發(fā)凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11]。為探討術(shù)芩增強免疫功能的機制，本試驗從術(shù)芩復(fù)方原藥材中提取其多糖，探討其對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬的影響，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度尋找術(shù)芩總多糖通過調(diào)控自噬進而調(diào)節(jié)機體免疫功能的客觀依據(jù)，進一步探索復(fù)方術(shù)芩總多糖調(diào)節(jié)仔豬冬季腹瀉的機制，為復(fù)方術(shù)芩應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明系小鼠，體重(20±2) g，健康，雌雄各半，購自西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物中心；復(fù)方術(shù)芩，由白術(shù)(4份)、黃芩(3份)、茯苓(3份)、黃芪(4.5份)、煨木香(2.5份)、廣藿香(2.5份)、干姜(2份)、甘草(1.5份)組成(中國專利號或?qū)＠暾執(zhí)枺?01310344433.4)[2]，購自四川千金中藥飲片有限公司，批號：160201；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，批號：8111185；Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)，購自Beyotime碧云天生物技術(shù)研究所，批號：11E24C60；ExCell澳洲胎牛血清，購自依科賽生物科技有限公司，批號：FBS11701；LC3B (D11) XP?Rabbit mAb，Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb，購自Cell Signaling Technology公司； Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084 sterile solution，購自GE Healthcare公司，批號：10240034；3-MA，購自Med Chem Express(MCE)，批號：23260。

術(shù)芩總多糖(polysaccharides from ZhuQin Formula，ZQp)，苯酚硫酸法測定糖含量為91.42%：由西南大學(xué)榮昌校區(qū)中獸藥創(chuàng)新實驗室提取并鑒定[12]。

1.2 主要儀器設(shè)備

Automated Cell Counter(BIO-RAD TC20TM)；Bio-Rad Model 680 Microplate Reader(美國Bio-Rad Laboratories，Inc)；3111型隔水式二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Electron Laboratories，USA)；4300化學(xué)發(fā)光拍攝器(上海勤翔)；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories，Inc)；AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)(瑞典法瑪西亞公司)；Trans-Blot SD蛋白半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories，Inc)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 術(shù)芩總多糖的提取[13-14]按比例稱取所需藥材共100 g，粉粹后加石油醚，加熱回流1 h，回流提取2次后離心，棄上清，揮干石油醚；加入80%乙醇回流提取2 h，提取2次后過濾；揮盡乙醇，用沸水回流提取2次，每次2 h。過濾，合并上清液，濃縮至100 mL。醇沉2次，加無水乙醇至醇含量達(dá)80%，4 ℃冰箱過夜，過濾，蒸餾水溶解沉淀。加savage試劑除蛋白，除5次以上至幾乎無蛋白。離心，蒸餾水溶解沉淀，再次醇沉后過濾。依次將沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，30 ℃干燥，得多糖。

苯酚硫酸法測定術(shù)芩總多糖含量為91.42%。所提取的術(shù)芩總多糖呈淡灰白色的粉末。

1.3.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)[15-16]參考文獻(xiàn)方法分離空白組小鼠、環(huán)磷酰胺致免疫低下模型組小鼠[12]淋巴細(xì)胞，用含10%FBS和2%慶大霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×106個·mL-1，分別培養(yǎng)空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞(簡稱空白組，kb)、環(huán)磷酰胺造模組小鼠脾淋巴細(xì)胞(簡稱模型組，M)備用。

1.3.3 細(xì)胞增殖的最佳條件 采用十倍稀釋法配制9個濃度組：濃度1(104μg·mL-1)、濃度2(103μg·mL-1)、濃度3(102μg·mL-1)、濃度4(10 μg·mL-1)、濃度5(1 μg·mL-1)、濃度6(10-1μg·mL-1)、濃度7(10-2μg·mL-1)、濃度8(10-3μg·mL-1)、濃度9(10-4μg·mL-1)。取不同濃度的術(shù)芩總多糖(ZQp)各100 μL加入96孔板中，后加入空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞3×106個·mL-1，100 μL·孔-1，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24、48 h，CCK-8法測定術(shù)芩總多糖使小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的最適濃度及時間。

1.3.4 測定免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖 試驗分為空白組(kb)、環(huán)磷酰胺免疫低下模型組(M)、模型+術(shù)芩總多糖組(術(shù)芩總多糖終質(zhì)量濃度為10-1μg·mL-1，M+ZQp)，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，終止培養(yǎng)前4 h，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后在酶標(biāo)儀上于450 nm 波長處讀出每孔吸光度(A)。

1.3.5 術(shù)芩總多糖+ConA對細(xì)胞增殖的影響 為了比較術(shù)芩總多糖、術(shù)芩總多糖+ConA對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，試驗分為空白組(kb)、術(shù)芩總多糖組(術(shù)芩總多糖終質(zhì)量濃度為10-1μg·mL-1，ZQp)、ConA組(ConA終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1，ConA)、術(shù)芩總多糖+ConA組(終質(zhì)量濃度分別為10-1、10 μg·mL-1，ZQp+ConA)，加入96孔板中，3×106個·mL-1，100 μL·孔-1，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24、48 h，終止培養(yǎng)前4 h，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后在酶標(biāo)儀上于450 nm波長處讀每孔吸光度(A)。

1.3.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白測定 將小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，以RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個·孔-1，每孔終體積為2 mL·孔-1，分為空白組(kb)、3-MA組(3-MA終濃度為10 mmol·L-1)、術(shù)芩總多糖+3-MA組(終質(zhì)量濃度分別為10-1μg·mL-1、10 mmol·L-1，ZQp+3-MA)，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后；參照文獻(xiàn)[17-19]，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液200 μL后，于4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，取其上清，定量，Loading Buffer與樣品充分混勻，煮沸10 min；SDS-PAGE蛋白電泳及轉(zhuǎn)印(10%分離膠、5%濃縮膠)：80 V恒壓，20 min電泳濃縮膠；然后將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳，至loading buffer全部電泳出PAGE膠；300 mA恒流轉(zhuǎn)印35～40 min，封閉，一抗4 ℃過夜；洗膜5次；二抗室溫孵育1 h，洗膜5次；加入ECL發(fā)光液；拍照，用ImageJ2x分析灰度值。

1.3.7 測定免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白 將小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，分別為空白組(kb)、模型組、模型+術(shù)芩總多糖組(術(shù)芩總多糖終濃度為10-1μg·mL-1，M+ZQp)，細(xì)胞數(shù)為5×105個·孔-1，每孔終體積為2 mL·孔-1，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；根據(jù)以上試驗結(jié)果，培養(yǎng)12 h收集細(xì)胞。Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)，方法同上。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖的最佳條件

試驗結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為1、10-1μg·mL-1的術(shù)芩總多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴細(xì)胞12 h，細(xì)胞的增殖能力增強，與空白組(kb)相比，差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；各劑量濃度術(shù)芩總多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞24、48 h，細(xì)胞增殖能力與空白組(kb)相比，無顯著性差異(P>0.05)，詳見圖1。

與空白對照組比，*. 差異顯著(0.01≤P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)Compared with blank control group, *. Significant difference (0.01≤P<0.05)；**. Extremely significant difference (P<0.01)圖1 術(shù)芩總多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的最佳條件Fig.1 The best conditions of ZQp on the proliferation of spleen lymphocytes in mice

2.2 術(shù)芩總多糖對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

模型組(M)脾淋巴細(xì)胞增殖能力降低，與空白組(kb) 相比，差異極顯著(P<0.01)；加入術(shù)芩總多糖(ZQp)后，細(xì)胞的增殖能力增強，與模型組(M)比，差異極顯著(P<0.01)，詳見圖2。

2.3 術(shù)芩總多糖+ConA對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的ConA作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞12 h，細(xì)胞增殖能力增強，但與空白組(kb)相比，差異不顯著(P>0.05)；濃度為10-1μg·mL-1的術(shù)芩總多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞12 h，細(xì)胞增殖能力增強，與空白組(kb)比，差異顯著(P<0.05)； ConA+術(shù)芩總多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞12 h，細(xì)胞增殖能力增強，與空白組(kb)比，差異顯著(P<0.05)。ConA+術(shù)芩總多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖能力增強，與ZQp組、ConA組相比，差異極顯著(P<0.01)。ConA+術(shù)芩總多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h，細(xì)胞增殖能力增強，與ZQp組相比，差異極顯著(P<0.01)，與ConA組相比，差異不顯著(P>0.05)，詳見圖3。

kb.空白組；M.環(huán)磷酰胺免疫低下模型組；M+ZQp.模型+術(shù)芩總多糖組(100 ng·mL-1ZQp作用12 h);相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。下圖同kb.Blank control;M.Cyclophosphamide induced immuno-compromised model group;M+ZQp.Model+ZQp group(100 ng·mL-1ZQp cultured for 12 h);Same letters means not significant difference between treatments (P>0.05)，different lowercase letters means significant difference (P<0.05), different capital letters means very significant difference between treatments (P<0.01). The same as below圖2 術(shù)芩總多糖對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of ZQp on the proliferation of spleen lymphocytes in immunocompromised mice

2.4 術(shù)芩總多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)的影響

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1蛋白的相對表達(dá)量為0.48±0.01，3-MA(自噬抑制劑)組小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1蛋白的相對表達(dá)量降低，為0.14±0.00，與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；3-MA+術(shù)芩總多糖(ZQp)組小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1蛋白的相對表達(dá)量升高，為0.16±0.00，與3-MA組比較，差異極顯著(P<0.01)，詳見圖4。

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表達(dá)的相對比值為0.66±0.02，3-MA組小鼠脾淋巴細(xì)胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表達(dá)的相對比值升高，為0.98±0.01，與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；3-MA+術(shù)芩總多糖(ZQp)組小鼠脾淋巴細(xì)胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表達(dá)的相對比值降低，為0.94±0.01，與3-MA組比較，差異顯著(0.01

圖3 術(shù)芩總多糖+ConA對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of ZQp+ConA on the proliferation of spleen lymphocytes in mice

kb.空白組;3-MA.自噬抑制劑組;3-MA+ZQp.3-MA+術(shù)芩總多糖組kb.Blank control;3-MA.3-methyladenine(autophagy inhibitor)group; 3-MA+ZQp.3-MA+ZQp group圖4 3-MA抑制時Beclin1蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of Beclin1 protein in 3-MA inhibition

kb.空白組;3-MA.自噬抑制劑組;3-MA+ZQp.3-MA+術(shù)芩總多糖組kb.Blank control;3-MA.3-methyladenine(autophagy inhibitor)group; 3-MA+ZQp.3-MA+ZQp group圖5 3-MA抑制時LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of LC3B Ⅱ/Ⅰ protein in 3-MA inhibition

2.5 術(shù)芩總多糖對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)的影響

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1的相對表達(dá)量為0.48±0.01，環(huán)磷酰胺致免疫低下模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1的相對表達(dá)量升高，為0.65±0.01，與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；M+術(shù)芩總多糖(ZQp)組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1的相對表達(dá)量降低，為0.32±0.00，與模型組相比，差異極顯著(P<0.01)，詳見圖6。

kb.空白組；M.環(huán)磷酰胺免疫低下模型組；M+ZQp.模型+術(shù)芩總多糖組kb.Blank control;M.Cyclophosphamide induced immunocompromised model group;M+ZQp.Model+ZQp group圖6 免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞Beclin1蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of Beclin1 protein in splenic lymphocytes of immunocompromised mice

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相對表達(dá)量為0.66±0.02，環(huán)磷酰胺免疫低下模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相對表達(dá)量升高，為0.90±0.01，與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；M+術(shù)芩總多糖(ZQp)組小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相對表達(dá)量降低，為0.55±0.03，與模型組相比，差異極顯著(P<0.01)，詳見圖7。

kb.空白組；M.環(huán)磷酰胺免疫低下模型組；M+ZQp.模型+術(shù)芩總多糖組kb.Blank control;M.Cyclophosphamide induced immunocompromised model group;M+ZQp.Model+ZQp group圖7 免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)Fig.7 Expression of LC3BⅡ/Ⅰ protein in splenic lymphocytes of immunocompromised mice

3 討 論

脾淋巴細(xì)胞增殖是反映機體細(xì)胞免疫與體液免疫最直接的指標(biāo)，通過促進淋巴細(xì)胞增殖，達(dá)到增強機體免疫力的目的[15]。本試驗中環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力降低，加入術(shù)芩總多糖后，增殖能力增強。說明術(shù)芩總多糖能促進免疫抑制小鼠體外淋巴細(xì)胞增殖，增強免疫功能。

自噬是細(xì)胞基本的代謝過程，它能降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以最有效的方式重復(fù)利用這些成分，來維持細(xì)胞的生存和組織自穩(wěn)。自噬參與了機體內(nèi)許多重要的生理活動，如細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡以及抵御外來病原微生物等。近年來，大量的研究表明，自噬參與淋巴細(xì)胞的發(fā)育、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答途徑[20]。本試驗中，環(huán)磷酰胺致免疫低下模型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖發(fā)育受損，Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)增加，自噬增強；加入術(shù)芩總多糖后，淋巴細(xì)胞的增殖能力增強，Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)降低，自噬減弱。說明自噬參與了淋巴細(xì)胞的發(fā)育，推測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖發(fā)育受損與Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)增加有關(guān)。

自噬發(fā)生的第一步是吞噬泡的形成，Beclin1主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在自噬的啟動階段發(fā)揮了重要作用，Beclin1與Class III PI3K(hVPS34)、Atg14形成三聚體，準(zhǔn)確的引導(dǎo)并不斷募集其它自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜，介導(dǎo)自噬起始[21]，在吞噬泡形成過程中起重要作用[22]。3-MA為特異性自噬抑制劑，通過抑制Class III PI3K的活性從而抑制自噬泡的形成，術(shù)芩總多糖能解除3-MA的抑制，通過上調(diào)Beclin1蛋白的表達(dá)，調(diào)控自噬泡的形成，從而激活抑制狀態(tài)下的自噬；在吞噬泡的隔離膜延長過程中，在Atg4作用下，LC3前體被加工成可溶性LC3-Ⅰ，后者在Atg7(E1樣酶)和Atg3(E2樣酶)作用下與磷脂酰乙醇胺(PE)連接成為脂溶性的LC3-Ⅱ-PE，參與自噬溶酶體膜的延伸，直到自噬溶酶體形成[23-24]。當(dāng)LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)的相對比值升高時，術(shù)芩總多糖能降低LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)，說明術(shù)芩總多糖也在吞噬泡的隔離膜延長過程中起作用，參與自噬溶酶體膜的延伸階段。

自噬是一把“雙刃劍”，一方面激活抑制狀態(tài)下低水平的自噬有利于激活機體正常的免疫水平，發(fā)揮積極的免疫功能；另一方面過高的自噬使機體正常的免疫細(xì)胞受損，導(dǎo)致Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[25-26]或自噬促使細(xì)胞凋亡的激活而導(dǎo)致Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡。本試驗中，術(shù)芩總多糖能增加3-MA抑制情況下低水平的自噬，降低環(huán)磷酰胺免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞中高水平的自噬，推測術(shù)芩總多糖能調(diào)節(jié)自噬的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)自噬抑制時，增加自噬；當(dāng)自噬增加時，降低自噬。自噬和凋亡在哺乳動物發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持中均發(fā)揮重要作用[27]。本試驗中自噬與凋亡是合作關(guān)系[28]，還是自噬促進了凋亡的發(fā)生，有待進一步研究。

同時，筆者還發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，當(dāng)Beclin1蛋白被3-MA抑制時，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)的相對比值反而升高，分析原因可能為：其一，LC3-Ⅱ的升高可能有兩方面的原因[29]，一是刺激了自噬，二是阻礙了自噬體與溶酶體的融合而導(dǎo)致自噬體積累，抑制自噬；其二， LC3在不同腫瘤中發(fā)揮的作用具有組織特異性，自噬深深融入到了細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡的途徑中，這些反應(yīng)可能因不同細(xì)胞類型而有所差異[30]；其三，細(xì)胞自噬是一個復(fù)雜的過程，多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與自噬水平的調(diào)節(jié)，并且細(xì)胞自噬可以在多種條件下被誘導(dǎo)，生長因子、細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平、葡萄糖水平、DNA損傷、氧自由基等均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平的變化，LC3BⅡ/Ⅰ的升高可能是受其他信號通路的調(diào)控[31-32]；其四，中醫(yī)藥治療疾病遵循整體平衡觀，其通過多環(huán)節(jié)、多靶點、多途徑共同發(fā)揮作用。推測術(shù)芩總多糖可能直接調(diào)控或者通過作用于其他途徑調(diào)控了LC3B蛋白的表達(dá)。當(dāng)Beclin1蛋白被3-MA抑制時，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)升高的機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

環(huán)磷酰胺能使小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖發(fā)育受損，可能通過激活過度的自噬導(dǎo)致Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，術(shù)芩總多糖能抑制過高的自噬，使淋巴細(xì)胞增殖能力增強。術(shù)芩總多糖通過調(diào)控Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表達(dá)，在自噬的起始和延伸階段發(fā)揮作用。