李國玲，王豪強(qiáng)，阮曉芳，莫健新，全 絨，鐘翠麗，李紫聰，吳珍芳,2，劉德武，張獻(xiàn)偉,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，新興 527439)

基因組自然產(chǎn)生或人為引入的雙鏈斷裂(double-strand break,DSB)是同源定向修復(fù)(homologous recombinant repair, HDR)或非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)發(fā)生的前提，傳統(tǒng)基因操作技術(shù)利用供體質(zhì)粒和自然產(chǎn)生的DSB，整合效率僅僅為10-5～10-7，為科研和生產(chǎn)帶來了極大的困難。新的基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，如鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN) 和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palidromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)系統(tǒng)等[1-3]，可在基因組內(nèi)高效引入DSB。這些基因編輯工具的出現(xiàn)以及升級和完善，使得基因組產(chǎn)生DSB的效率得到充分的保障，為開發(fā)定點(diǎn)整合的模式動物提供了有利的條件。雖然細(xì)胞產(chǎn)生DSB的效率得到了極大的提高，但細(xì)胞利用HDR介導(dǎo)的DNA精確修復(fù)率仍然十分低下，只有大約0.5%～20.0%。而與之競爭的NHEJ發(fā)生效率卻高達(dá)80%[1-3]。由于NHEJ修復(fù)方式是強(qiáng)行將2個DNA斷端連接在一起，修復(fù)過程中容易產(chǎn)生核苷酸片段的隨機(jī)插入、缺失或突變等[4-5]。而利用HDR可實(shí)現(xiàn)外源基因或調(diào)控序列的精確插入或缺失，是基因組定點(diǎn)整合最為依賴的修復(fù)機(jī)制[5-6]。

研究表明，通過小分子化合物激活HDR蛋白或抑制NHEJ蛋白可促進(jìn)DNA的準(zhǔn)確修復(fù)，其中能顯著提高細(xì)胞HDR效率的小分子化合物有Scr7、L755507、Brefeldin A、CHIR99021和RS-1等[7-12]。Maruyama等[8]使用Scr7處理后的哺乳動物細(xì)胞將小片段整合至4個靶基因的效率提高了19倍，而注射Scr7至小鼠受精卵使定點(diǎn)整合效率提高了2倍以上；Yu等[12]利用高通量藥物篩選的策略發(fā)現(xiàn)，L755507 (β3腎上腺素受體激動劑)或Brefeldin A(蛋白轉(zhuǎn)動抑制劑)可將GFP片段整合進(jìn)Nanog基因的效率分別提高3倍和2倍。Lin等[7]通過PD0325901、CHIR99021分別抑制小鼠胚胎干細(xì)胞MEK(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase)和GSK3b信號通路，將Neo基因定點(diǎn)整合效率提高約1～5倍；Song等[11]結(jié)合CRISPR/Cas9和TALEN技術(shù)，利用Rad51蛋白的激活劑RS-1將GFP基因靶向大鼠RLL基因效率提高2～5倍。雖然已經(jīng)有較多小分子化合物被應(yīng)用于提高DNA精確修復(fù)效率，但這些研究主要集中在人和小鼠，在豬上的研究鮮有報道。由于與人類生理特征具有諸多相似性，豬可以作為良好的人類疾病動物模型，有利于探索疾病的致病機(jī)制，開發(fā)治療藥物和診治途徑，是人疾病臨床前研究的重要環(huán)節(jié)[6, 13-14]。

因此，本研究利用HDR通路修復(fù)關(guān)鍵因子Rad51激活劑RS-1、Wnt信號關(guān)鍵因子GSK-3抑制劑Chir99021和成纖維細(xì)胞生長因子受體FGFR1抑制劑PD173074處理豬胎兒成纖維細(xì)胞，研究其對PFFs內(nèi)HR、SSA和ssODN介導(dǎo)的修復(fù)途徑的影響，為提高豬細(xì)胞內(nèi)DNA精準(zhǔn)修復(fù)效率打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SSA報告載體、HR報告載體、ssODN報告載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；PFFs由廣東溫氏種豬科技有限公司提供；90 nt的單鏈寡核苷酸ssODN由華大基因合成，序列為5′-ACATGAAGCAGCACG-ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCT-ACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGG-ACGACGGCAACTACA-3′；Rad51激活劑RS-1、GSK-3抑制劑Chir99021和FGFR1抑制劑PD173074購自Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 小分子化合物處理PFFs的方法 當(dāng)PFFs培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為50%～80%(8×106)時，分別將不同濃度的小分子化合物RS-1、Chir99021和PD173074添加至細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。其中RS-1濃度分別為25、10、5和1 μmol·L-1；Chir99021濃度分別為5、2、1和0.5 μmol·L-1；PD173074濃度分別為1、0.5、0.25和0.1 μmol·L-1。

1.2.2 PFFs DNA損傷修復(fù)因子表達(dá)水平的檢測 小分子化合物處理PFFs 48 h后抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對PFFs DNA損傷修復(fù)因子cDNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測：LIG4 (NC_010453.5)、PNKP(NC_010448.4)、NHEJ1 (NC_010457.5)、XRCC5 (NC_010457.5)、XRCC6 (NC_010447.5)和Rad51 (NC_010443.5)的相對表達(dá)量。

表1熒光定量PCR引物序列信息

Table1Theprimersequenceofreal-timePCR

基因Gene序列(5′→3′) Sequence產(chǎn)物/bp ProductLIG4FGCCGCTATCGCAGACATTG251RGCCATCATCTCACCATCAAGGPNKPFGGACCGTGGCAGTGAAACAG221RCTCTTCCTCCTCCTCGTGTGGNHEJ1FGCAGTGTTGGTGATGGAAGAC176RTGGCTCCTCTGGCTGGTTCXRCC5FGAGGAAGGCACCGTTGAAG188RGAGAGAGGAATCTGACACTTAGCXRCC6FGCGATGAAGAAGAAGAAGAGGAG225RCATAGAACACCACTGCCAAGAGRad51FCGTTCAACACAGACCACCAG187RGCAAGTCGCAGAAGCATCC

F.上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R.Reverse primer

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測PFFs細(xì)胞周期分布 小分子化合物處理PFFs 48 h后，消化細(xì)胞，棄上清，用約1 mL預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。加入1 mL -20 ℃的70%乙醇，邊加邊振蕩，于4 ℃固定過夜。過夜的細(xì)胞250 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，以1 mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入1 mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(500 μL PBS含50 μg·mL-1PI，100 μg·mL-1RNase A，0.2% Triton X-100含10 μL的Triton-X 100)，充分振蕩，4 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。使用Modifit 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PFFs報告載體精準(zhǔn)修復(fù)效率 當(dāng)傳代后的PFFs匯合度達(dá)到50%～80%(8×106)時，參考Thermo fisher的Lipofectamine?LTX & Plus Reagent protocol說明書，每孔分別轉(zhuǎn)染1.5 μg·孔-1Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶線性化的SSA、HR、ssODN報告載體。轉(zhuǎn)染6 h后按步驟“1.2.1”分別添加小分子化合物至轉(zhuǎn)染的PFFs中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞熒光數(shù)的百分比。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣品T-test分析，分別分析每個處理組與對照組的差異水平。數(shù)據(jù)以“Mean ± SEM”表示，*表示P<0.05， **表示P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 小分子化合物對豬PFFs DNA損傷修復(fù)因子表達(dá)水平的影響

經(jīng)不同劑量的Chir99021和PD173074處理后，PFFs DNA損傷修復(fù)因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6和Rad51表達(dá)水平都顯著下調(diào)(P<0.05)，而經(jīng)不同濃度PD173074(0.1～1 μmol·L-1)處理后，PNKP因子表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。Chir9902處理組僅在0.5 μmol·L-1劑量下，PNKP因子表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。此外，RS-1作為Rad51基因的激活劑，不但沒有提高PFFs中Rad51因子的表達(dá)，在高劑量時，反而表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P<0.05)。同時，高劑量的RS-1還顯著抑制LIG4、NHEJ1、XRCC5和XRCC6基因的表達(dá)(P<0.05)，而對PNKP的表達(dá)表現(xiàn)為促進(jìn)作用(P<0.05)(圖1)。

圖1 小分子化合物對豬DNA損傷修復(fù)因子表達(dá)水平的影響Fig.1 The effects of small molecule compounds on porcine DNA repair factors expression

2.2 小分子化合物對豬PFFs細(xì)胞周期的影響

PFFs經(jīng)高劑量的RS-1和PD173074處理后，均顯著減少S期的細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，而對G2期細(xì)胞無顯著影響(P>0.05)。2μmol·L-1Chir99021可顯著將細(xì)胞周期阻滯在S期(P<0.05)，減少G2期細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)。

圖2 小分子化合物對豬PFFs細(xì)胞周期的影響Fig.2 The effects of small molecule compounds on porcine PFFs cell cycle distribution

2.3 小分子化合物對豬PFFs SSA介導(dǎo)的精確修復(fù)效率的影響

經(jīng)3種不同濃度的小分子化合物處理后，僅Chir99021具有提高SSA修復(fù)效率的能力，SSA修復(fù)效率分別提高了18.4%(2μmol·L-1，P<0.05)和39.5%(5μmol·L-1， P<0.05)。相反，RS-1可顯著降低SSA修復(fù)效率(P<0.05)，而PD173074對SSA修復(fù)方式?jīng)]有顯著影響(P>0.05)(圖3)。

2.4 小分子化合物對豬PFFs HR修復(fù)效率的影響

本研究結(jié)果顯示，低劑量RS-1、Chir99021和PD173074具有促進(jìn)PFFs細(xì)胞HR修復(fù)的作用(P<0.05)，如：RS-1的5和1μmol·L-1兩個水平，Chir99021的2、1和0.5μmol·L-13個水平，PD173074的0.25和0.1μmol·L-1兩個水平，其中Chir99021對HR修復(fù)效率提高最明顯(P<0.05)，最高可達(dá)2.1%(0.5μmol·L-1)，與對照組相比，其HR效率提高了169.7% (P<0.05)。然而，高劑量的RS-1、Chir99021和PD173074對HR修復(fù)效率改善作用不明顯(P>0.05)，沒有隨劑量增大而提高，表明PFFs細(xì)胞中HR修復(fù)方式對RS-1、Chir99021和PD173074 3種藥物沒有劑量依賴性不明顯(圖4)。

2.5 小分子化合物物對豬PFFs發(fā)生ssODN介導(dǎo)的精確修復(fù)的影響

本研究利用不同濃度的RS-1、Chir99021和PD173074處理PFFs細(xì)胞，分析其對ssODN修復(fù)路徑效率的影響，結(jié)果顯示，3種不同濃度小分子化合物對PFFs中ssODN修復(fù)效率均沒有顯著影響(P>0.05)(圖5)。

3 討 論

在細(xì)胞周期過程中，NHEJ可以發(fā)生在細(xì)胞分裂的任何一個時期，而HR主要發(fā)生在S和G2期[15-17]。利用這個規(guī)律，可以為研究者提供一個提高定點(diǎn)整合效率的方法。2016年，Yang等[18]利用ABT化合物誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞停滯在S期，隨后將2～5kb的序列整合至人基因組5個區(qū)域，將定點(diǎn)整合效率提高約3～6倍；而Lin等[19]在人H293T、成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中添加能使細(xì)胞停滯在G2期的aphidicolin和nocodazole后，顯著提高了小片段的同源重組效率，但同時也發(fā)現(xiàn)，有些可使細(xì)胞停滯在G2期的藥物并沒有起到顯著作用，甚至降低同源重組修復(fù)效率。本研究使用的Rad51激活劑RS-1、GSK-3抑制劑Chir99021和FGFR1抑制劑PD173074目前暫沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道其對細(xì)胞周期有具體的影響[11, 20-21]，本研究發(fā)現(xiàn)，RS-1和PD173074處理后，均顯著減少S期的細(xì)胞數(shù)量，而對G2期細(xì)胞無影響。高劑量Chir99021可將細(xì)胞周期阻滯在S期，減少G2期細(xì)胞數(shù)量。通過報告SSA載體也表明，Chir99021將細(xì)胞阻滯在S期時，顯著提高HDR和SSA的修復(fù)效率，而RS-1減少S

A. SSA修復(fù)的模式圖：pCD3.1-GFP載體補(bǔ)充核酸內(nèi)切酶Hind III線性化后，產(chǎn)生的DSB被同源的200 bp repeat發(fā)生單鏈退火修復(fù)時，GFP表達(dá)框修復(fù)完整，細(xì)胞可以檢測到綠色熒光信號，否則細(xì)胞不產(chǎn)生熒光；B. 流式細(xì)胞術(shù)檢測PFFs發(fā)生SSA修復(fù)后的熒光信號圖；C. 3種小分子化合物處理PFFs后發(fā)生SSA修復(fù)效率的統(tǒng)計結(jié)果(n=3)A.Schematic diagram of the SSA reporter system. The reporter system contained two 200 bp repeats in the same direction fanking the Hind III restriction site of pCD3.1-GFP plasmid. Upon nuclease cleavage, the generated DSB could be repaired by single strand annealing (SSA), directed by the overlapping repeated sequences, otherwise, the GFP expression can’t be detected. B. Fluorescence detection of SSA efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of SSA efficiency in PFFs treated with different concentrations of the 3 small molecule compounds (n=3)圖3 豬PFFs中SSA介導(dǎo)的同源重組修復(fù)效率檢測結(jié)果Fig.3 Result of SSA-mediated HDR efficiency in porcine PFFs

期細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)為顯著降低SSA修復(fù)效率，而對HDR效率影響不顯著，其具體調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

靶位點(diǎn)產(chǎn)生DSB后，機(jī)體的DNA修復(fù)既可通過HR修復(fù)路徑，也可通過NHEJ路徑，兩者之間存在競爭關(guān)系。因而采取激活HR或抑制NEHJ的策略都可以提高基因組定點(diǎn)整合效率。有研究報道，共轉(zhuǎn)干擾人或小鼠細(xì)胞的Ku70/80的shRNA、1.1kb的插入序列和Cas9質(zhì)粒，使定點(diǎn)整合效率提高4～5倍；Bertolini等[22]通過RNAi敲減Ku70和Xrcc4在HCT116細(xì)胞的表達(dá)，顯著降低了隨機(jī)整合的效率，同時將插入200bp左右片段的定點(diǎn)整合效率提高3～4倍。此外，Maruyama等[8]使用LIG4的抑制劑Scr7處理哺乳動物細(xì)胞，將小片段整合至4個靶基因的效率提高19倍，而注射Scr7至小鼠受精卵使定點(diǎn)整合效率提高2倍以上；隨后Chu等[9]發(fā)現(xiàn)，Cas9串聯(lián)表達(dá)LIG4的抑制蛋白E1B55K和E4orf6也可將小片段整合效率提高8倍。同時本課題組前期通過干擾豬胎兒成纖維細(xì)胞Ku70/80的表達(dá)，也顯著提高了HR效率[23]。上述研究均表明，抑制NHEJ通路的關(guān)鍵因子可一定程度提高基因組定點(diǎn)整合的效率。本研究中，Chir99021、RS-1和PD173074處理胎兒成纖維細(xì)胞后，在一定濃度下都可顯著下調(diào)NHEJ關(guān)鍵修復(fù)因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6基因表達(dá)水平，似乎暗示這些小分子化合物具有提高HR效率的潛力。

A.HR修復(fù)的模式圖：pCD3.1-deficient GFP載體被核酸內(nèi)切酶Hind III線性化后，產(chǎn)生的DSB被沒有啟動子的donor質(zhì)粒的GFP(同源臂350 bp)進(jìn)行同源重組修復(fù)，GFP表達(dá)框修復(fù)完整，細(xì)胞可以檢測到綠色熒光信號，而沒有發(fā)生同源重組的質(zhì)粒則沒有熒光表達(dá)；B. 流式細(xì)胞術(shù)檢測PFFs發(fā)生HR效率的熒光信號圖；C. 3種小分子化合物處理PFFs后發(fā)生HR修復(fù)效率的統(tǒng)計結(jié)果(n=3)A.Schematic diagram of the HR reporter system: This system consists of a target vector(pCD3.1-deficient GFP) expressing a deficient EGFP, in which a stop codon and a restriction site are introduced, and a donor plasmid containing a promoter-free intact EGFP gene with approximately 350 bp homology arms specific to the target vector. After homologous recombination, the GFP signal can be detected in cells, otherwise, no GFP expression. B. Fluorescence detection of HR efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of HR efficiency in PFFs treated with different concentrations of the three small molecule compounds (n=3)圖4 豬PFFs中HR介導(dǎo)的重組修復(fù)效率檢測結(jié)果Fig.4 Result of HR-mediated HDR efficiency in porcine PFFs

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測綠色熒光細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Chir99021、RS-1和PD173074處理均可提高HDR修復(fù)效率，與NHEJ關(guān)鍵修復(fù)因子表達(dá)水平結(jié)果相一致。由于SSA與ssODN修復(fù)通路較HDR修復(fù)通路更為復(fù)雜，其過程中不僅需要HDR通路因子如Ras52等的參與，也需要NHEJ通路因子如LIG3等的參與[24]，所以小分子化合物處理細(xì)胞后對SSA修復(fù)與ssODN修復(fù)效率的影響需要更深入的研究。此外，本研究中,RS-1并沒有提高Rad51的表達(dá)，但其低濃度卻提高HDR效率，這可能與其顯著抑制了LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6、Rad51基因的表達(dá)有關(guān)。但作為Rad51的激活劑，RS-1卻下調(diào)了Rad51的表達(dá)，與文獻(xiàn)報道不一致，分析這可能與本研究采用細(xì)胞的類型或種屬有關(guān)[11, 25]。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Scr7在豬上可顯著抑制LIG4的表達(dá)，提高HR效率，但Song等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Scr7在兔上并沒有顯著作用，因此作為人和小鼠Ras51促進(jìn)劑的RS-1在豬胎兒成纖維細(xì)胞可能導(dǎo)致其對Rad51的促進(jìn)效果并不明顯，導(dǎo)致對HR效率存在差異。此外，也有研究表明[26-27]，過表達(dá)內(nèi)源性的Rad51也會導(dǎo)致HR效率的降低，因此其具體調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

A. ssODN修復(fù)的模式圖：在單鏈長片段ssODN修復(fù)下，有DSB的缺陷GFP質(zhì)粒與左右各45 nt，共90 nt的ssODN發(fā)生同源重組，GFP表達(dá)框修復(fù)完整，細(xì)胞可以檢測到綠色熒光信號，而沒有發(fā)生同源重組的質(zhì)粒則沒有熒光表達(dá)；B. 流式細(xì)胞術(shù)檢測PFFs發(fā)生ssODN效率的熒光信號圖；C. 3種小分子化合物處理PFFs后發(fā)生ssODN修復(fù)效率的統(tǒng)計結(jié)果(n=3)A.Schematic diagram of the ssODN repair system: The DSB of defective GFP reconstitutes a functional GFP-coding sequence with the 90 nt single-stranded oligonucleotide (45 nt left and right,respectively), and the GFP signal can be detected in cells, however, without homologous recombination, the GFP can’t be expressed in cells. B. Fluorescence detection of ssODN efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of ssODN-mediated efficiency in PFFs treated with different concentrations of the 3 small molecule compounds (n=3)圖5 豬PFFs發(fā)生ssODN介導(dǎo)的修復(fù)效率檢測結(jié)果Fig.5 Result of ssODN-mediated repair efficiency in porcine PFFs cells

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度小分子化合物的應(yīng)用有利于不同策略的基因敲入細(xì)胞系的產(chǎn)生，為獲得精確的遺傳修飾動物模型打基礎(chǔ)。