郭毓菲，張詩泉，王漢迪，李曉潔，曾百慧，胡 婷，向 福，吳 鵬*

（黃岡師范學院 生命科學學院 經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）又稱茯靈，屬多孔菌科。九資河茯苓聞名中外，是一種名貴的中藥材，可安神、健脾，在治療水腫、腎炎方面有顯著功效。茯苓多糖主要存在于茯苓細胞壁中，具有促進細胞分裂、補體激活、增強免疫力、抗炎、消除自由基、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等作用[1-5]，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑，具有抗炎、抗腫瘤和增強免疫等作用。

茯苓多糖的提取方法[6]主要有稀堿浸提法[4]、超聲波輔助酶法[7]、復合酶法[8]、發(fā)酵法[9]等，稀堿浸提法工藝流程復雜，操作較麻煩；發(fā)酵法耗時較長；復合酶-水浸提法必須嚴格控制變量。而超聲波由于其獨特的物理化學效應，近年來被廣泛運用于部分中藥材的多糖提取。該方法操作簡單方便、耗時短、提取率高。但目前茯苓多糖的提取無法達到工業(yè)化。

中藥多糖類物質(zhì)抗氧化作用研究報道較多[10-11]，羧甲基茯苓多糖抗氧化作用已見文獻報道[12]。本研究采用超聲波法提取茯苓多糖，并對其提取工藝條件進行優(yōu)化。同時通過測定茯苓多糖的總抗氧化力、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率，對其抗氧化活性進行研究，以期為茯苓多糖的開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九資河茯苓：市售。

苯酚重蒸餾試劑（純度80%）、濃硫酸（純度95.5%）、維生素C（vitaminC，VC）、氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、DPPH、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；scientz-IIDM微波光波超聲波萃取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；732型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市順華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖的提取

采用超聲波法提取茯苓多糖[4-5]。挑選成色較好的茯苓塊于（48±2）℃條件下恒溫干燥48h，打磨成粉狀，過篩80目，取樣品1 g與水按一定料液比溶解，放入超聲波萃取儀中于20℃條件下提取茯苓多糖（超聲波間歇時間為3 s），經(jīng)超聲波提取后于3000r/min條件下離心20 min，離心后取上清液進行抽濾，抽濾液備用。

1.3.2 茯苓多糖的測定

采用苯酚-硫酸法測定茯苓多糖含量[13-14]。

葡萄糖標準曲線的繪制：準確稱取標準葡萄糖10 mg于250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分別吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL于小燒杯中，用蒸餾水補至2.0 mL，然后分別加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖勻冷卻，置沸水浴顯色15 min后室溫冷卻，采用分光光度計測定波長490 nm處的吸光度值。用2.0mL蒸餾水作為空白對照，制得葡萄糖標準曲線為y=0.010 8x+0.004 2，R2=0.999，線性關(guān)系良好，說明可用于茯苓多糖得率的測定。

樣品中茯苓多糖含量的測定：取2 mL待測樣品，添加1.0 mL 6%的苯酚溶液，再加入5.0 mL濃硫酸，置沸水浴顯色15min后室溫冷卻，測定其在波長490nm處的吸光度值。

根據(jù)葡萄糖標準曲線計算得出茯苓多糖的提取量，進而得出茯苓多糖的得率，其計算公式如下：

式中：w為茯苓總多糖得率，%；c為樣品液中葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL；d為稀釋倍數(shù)；v為提取液總體積，mL；m為所稱樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化單因素試驗

超聲波功率對茯苓多糖得率的影響：準確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，按料液比1∶40（g∶mL）加入蒸餾水中，調(diào)節(jié)超聲波功率分別為150 W、175 W、200 W、225 W、250 W進行超聲波提取，超聲時間為15 min，考察不同超聲波功率對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復3次。

料液比對茯苓多糖得率的影響：準確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）加入蒸餾水中，在超聲波功率200 W條件下進行超聲波提取，超聲時間為15 min，考察不同料液比對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復3次。

超聲時間對茯苓多糖得率的影響：準確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，按料液比為1∶40（g∶mL）加入蒸餾水中，在超聲波功率200W條件下進行超聲波提取，調(diào)節(jié)超聲時間為5 min、10 min、15min、20min、25min，考察不同超聲時間對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復3次。

1.3.4 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化響應面試驗[16]

響應面分析法將多因素試驗中因素與指標的相互關(guān)系用多項式近似擬合，依此對函數(shù)的響應面和等高線進行分析，進而研究因素與響應面之間、因素與因素之間的相互關(guān)系[15，17-18]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以茯苓多糖得率（Y）為響應值，選擇超聲波功率（A）、料液比（B）、超聲時間（C）為影響因素設(shè)計響應面試驗[19]，響應面試驗的因素與水平見表1。

表1 茯苓多糖提取工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

1.3.5 茯苓多糖抗氧化活性探究

抗氧化能力[20]：取30支試管，依次加入0.2mol/L、pH=6.6的磷酸鈉緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0 mg/mL）的樣品溶液和VC溶液2.0 mL，50℃恒溫水浴保溫20 min，取出后加入2.0 mL 10%三氯乙酸，振蕩搖勻，3 000 r/min離心15 min。吸取2.0 mL上清液于試管中，加入2.0 mL蒸餾水，再加入0.5 mL 0.1%氯化鐵，混合均勻后，于室溫條件下反應10 min，在波長700 nm處測定吸光度值，每個質(zhì)量濃度作3組平行試驗。吸光度值越高，說明還原力越高。

DPPH自由基清除率：分別取不同質(zhì)量濃度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL）的樣品溶液和相同質(zhì)量濃度的VC2.0mL于試管中，加入2.0mL2×10-4mol/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應30min，在波長513 nm處測定其吸光度值A(chǔ)1，同時測定不加樣品溶液的空白樣的吸光度值A(chǔ)0，每個質(zhì)量濃度作3組平行試驗。對DPPH自由基的清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對茯苓多糖得率的影響

超聲波功率對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波功率對茯苓多糖得率的影響。Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of pachyman

由圖1可以看出，超聲波功率對茯苓多糖得率的影響很大。當超聲功率在150～200 W范圍內(nèi)，茯苓多糖得率隨著超聲波功率的升高而增加；當超聲波功率為200 W時，茯苓多糖得率達到最大，為1.74%；當超聲波功率＞200 W之后，茯苓多糖得率隨著超聲波功率的升高而下降，分析原因可能是超聲波功率過高，破壞了多糖的結(jié)構(gòu)[17]，導致多糖得率降低。因此，超聲功率200 W為宜。

2.1.2 料液比對茯苓多糖得率的影響。

料液比對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對茯苓多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the yield of pachyman

由圖2可以看出，料液比影響茯苓多糖的得率。當料液比在1∶30～1∶35（g∶mL）時，茯苓多糖得率隨著料液比的變化而增加；當料液比為1∶35（g∶mL）時，茯苓多糖得率達到最大，為1.62%；當料液比在1∶35～1∶50（g∶mL）時，茯苓多糖得率隨著料液比的變化而下降，分析原因可能是茯苓粉含量減小，提取出的多糖濃度減小。因此，料液比1∶35（g∶mL）為宜。

2.1.3 超聲時間對茯苓多糖得率的影響

超聲時間對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對茯苓多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of pachyman

由圖3可以看出，超聲時間對茯苓多糖得率影響顯著。當超聲時間在5～25 min范圍內(nèi)時，茯苓多糖得率隨著超聲功率的升高而減??；當超聲時間為10 min時，茯苓多糖得率達到最大，為2.08%；當超聲時間在10～30 min時，茯苓多糖得率隨著超聲時間的升高而下降；當超聲時間＞15 min之后，超聲時間對茯苓多糖得率影響較小，因為超聲時間過長，影響了多糖的分子鏈，對多糖結(jié)構(gòu)造成了破壞[21]，致使得率降低。因此，超聲時間10min為宜。

2.2 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以茯苓多糖得率（Y）為響應值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計對茯苓多糖得率影響顯著的3個因素超聲波功率（A）、料液比（B）、超聲時間（C）進行3因素3水平的響應面試驗分析，結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 茯苓多糖提取工藝優(yōu)化響應面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合[7，16]，得出茯苓多糖得率對超聲波功率（A）、料液比（B）及超聲時間（C）的二次多項回歸方程：

Y=-10.068 25+0.045 20A+3.955 00B+0.148 20C-9.600 00AB-7.200 00AC-1.940 00BC-1.056 00A2-3.920 00B2-3.000 00C2

由表3可知，該模型的P=0.007 1＜0.01，極顯著；失擬項P=0.798 1＞0.05，不顯著，表明該方程合理可靠。一次項A、B、C和交互項AB、AC、BC對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），二次項B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），A2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。3個因素對茯苓多糖得率的影響主次順序為C＞A＞B，即超聲時間＞超聲波功率＞料液比。

由響應面分析法求得超聲波提取茯苓多糖的最佳工藝條件為超聲波功率194.52 W、料液比1∶34.31（g∶mL）、超聲時間11.27 min，理論茯苓多糖得率為2.096%，考慮在實際操作上的方便性，將各因素修正為超聲波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超聲時間11 min。

2.2.2 驗證試驗

在最優(yōu)工藝條件下進行驗證試驗，通過3次平行試驗，得出實際茯苓多糖得率為（2.084±0.012）%，與回歸方程預測值2.096%基本吻合，所以該模型有效。

2.2.3 交互項對茯苓多糖得率的影響

超聲波功率、料液比及超聲時間的交互作用對茯苓多糖得率影響的響應面及等高線見圖4。

圖4 超聲波功率、料液比及超聲時間的交互作用對茯苓多糖得率影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic power,solid to liquid ratio and ultrasonic time on the yield of pachyman

由圖4可知，超聲波功率和料液比、料液比和超聲時間、超聲波功率和超聲時間對茯苓多糖得率的影響均不顯著（P＞0.05）。

2.3 茯苓多糖抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 總抗氧化能力測定結(jié)果

茯苓多糖及VC的總抗氧化能力測定結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當茯苓多糖質(zhì)量濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，茯苓多糖的總抗氧化能力隨茯苓多糖質(zhì)量濃度的增大而增大。當茯苓多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，總抗氧化能力最高，即吸光度值最大，為0.219。與陽性對照品VC比較，茯苓多糖樣品的總抗氧化能力＜VC。

圖5 茯苓多糖的總抗氧化能力測定結(jié)果Fig.5 Determination results of total antioxidant capacity of pachyman

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

茯苓多糖及VC對DPPH自由基的清除率測定結(jié)果見圖6。

圖6 茯苓多糖DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.6 Determination results of DPPH free radical scavenging rate of pachyman

由圖6可知，當茯苓多糖質(zhì)量濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，茯苓多糖對DPPH自由基的清除能力并不明顯，且均＜20%。當茯苓多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，茯苓多糖對DPPH自由基的清除率最大，達到13%。與陽性對照品VC比較，茯苓多糖的DPPH自由基清除率均＜VC。

3 結(jié)論

本研究以茯苓多糖得率為響應值，利用響應面法對超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件：超聲波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超聲時間11 min。在此最優(yōu)提取條件下，茯苓多糖得率為2.08%。通過對茯苓多糖抗氧化活性的研究得出，當茯苓多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，總抗氧化能力最高，為0.22；當茯苓多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，茯苓多糖對DPPH自由基的清除率最大，為13%，但均低于陽性對照VC。