張 玉，周冉冉，李可心，黃 宇，陳茂彬*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；3.工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068）

酯酶（EC 3.1.1.1）是能催化芳香酯、脂肪酸酯等水解的酶的統(tǒng)稱[1]，在化學(xué)合成、食品調(diào)味品和醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-4]。源于真菌的酯酶可以催化水解作用的逆反應(yīng)，即合成反應(yīng)，如在非水性環(huán)境中的酯化作用和酯交換等反應(yīng)[5]。酯酶在有機溶液中的催化合成反應(yīng)具有增加疏水性底物的溶解度[6]、朝向合成的熱力學(xué)平衡轉(zhuǎn)移[7]和底物特異性改進[8]等優(yōu)點。

酯酶可以從微生物，特別是細菌和真菌中高量生產(chǎn)[9]。根據(jù)生物學(xué)特性和保守區(qū)序列，細菌中的酯酶被劃分為8個家族[10]，且近些年來不斷報道出新的家族成員[11-14]。然而，只有一部分酯酶進行了結(jié)構(gòu)和功能的鑒定[15-17]。從真菌中也分離和純化出一些酯酶，前期報道，在中國傳統(tǒng)發(fā)酵紅米中發(fā)現(xiàn)了116個紫色紅曲霉（M.purpureus）M7的候選酯酶基因，在這些酯酶基因中，只有酯酶Lip10和Lip2屬于新的酯酶家族成員[14，18]。

雖然一些酯酶已經(jīng)被分離、鑒定，但是尋找具有更高的熱穩(wěn)定性和更寬的底物選擇性的新型酯酶仍迫在眉睫[19]。酯酶在工業(yè)生產(chǎn)過程中需要反復(fù)使用，因此，需要相當好的穩(wěn)定性，且真菌產(chǎn)生的酯酶通常是胞外酶，很容易通過純化獲得[20]。因此，本研究以白酒高溫大曲中篩選出的一株耐高溫酯酶產(chǎn)生菌株HQ為研究對象，對其進行了分子生物學(xué)鑒定，并對其所產(chǎn)的酯酶進行分離純化、分子特性分析和酶學(xué)特征研究，為現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株HQ：分離自白酒高溫大曲，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

胰蛋白酶（250 U/mg）：北京華邁科生物技術(shù)有限責任公司；PTH-氨基酸標品（純度＞98.0%）：日本Shimadzu Corporation公司；其他試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO40.2%。115℃滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，F(xiàn)eSO40.001%，KCl 0.05%，MnSO40.03%。用乳酸調(diào)pH值為6.0，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHJH-1214B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造公司；Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)：上海天能公司；ultrafleXtreme基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間-質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionizationtimeofflight-massspectroscopy，MALDI-TOF-MS）、ultimate 3000色譜儀：美國布魯克·道爾頓公司；PPSQ-31A蛋白測序儀：日本島津公司；AKTA prime plus柱層析系統(tǒng)：美國GE Healthcare公司；丁基瓊脂糖柱26/60 Superdex G-200柱：美國Amersham公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分子生物學(xué)鑒定

按照SAMBROOK J等[21]的方法提取菌株HQ的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），根據(jù)18S rDNA的D2序列設(shè)計一對通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。采用引物對ITS1/ITS4進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系：無菌水 17.8 μL，Buffer：3 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphated，NTP）2 μL，ITS1 3 μL，ITS4 3 μL，DNA模板1 μL，Taq酶 0.2 μL；PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進行驗證，PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因公司測序，測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上進行Blast比對搜索，獲得同源性較高菌株序列，采用MEGA軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的親緣關(guān)系。

1.3.2 粗酶液的制備

種子液的制備：挑取斜面上的紫色紅曲霉HQ接種于種子培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)4 d后過濾，制成種子液備用。

液體發(fā)酵：按10%（V/V）的接種量將種子液接種于含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。先靜置12 h，然后在30℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)。接種后每隔12 h取一批樣，每批取3次，用4層紗布過濾，菌絲用無菌水沖洗幾次，直至表面色素清洗干凈，烘干稱質(zhì)量。同時測定發(fā)酵液中酯酶的酶活性。

1.3.3 胞外酯酶的分離純化

液體發(fā)酵5 d后，將培養(yǎng)液在濾紙上過濾，去除菌絲體。添加終濃度為2 mmol/L的芐脒（絲氨酸蛋白酶抑制劑）到液體發(fā)酵液中，以防止整個純化過程中蛋白質(zhì)發(fā)生水解。

利用硫酸銨分級沉淀純化發(fā)酵液中的酯酶[22]。取6份50 mL粗酶液，分別向每份粗酶液中緩慢加入碾細的（NH4）2SO4粉末，使其飽和度分別為0、20%、30%、40%、50%、60%，（NH4）2SO4溶解后靜置30 min，10 000×g、4 ℃條件下離心15 min，測定上清液酯酶活力。選取酯酶活力最高的上清液按體積均分為6份，分別加入（NH4）2SO4粉末，使其飽和度分別為70%、75%、80%、85%、90%，待（NH4）2SO4充分溶解后，靜置30 min，10 000×g、4℃條件下離心15 min，棄上清，收集沉淀。將上述沉淀用20mmol/LTris-HCl（pH 8.0）緩沖液充分溶解，定容至25 mL，檢測剩余酯酶活力。

在上述酶活力最高的基礎(chǔ)上，10 000×g、4℃條件下離心15 min，將上清液加入到丁基瓊脂糖柱（2.5 cm×30 cm），利用10倍柱體積的含有1 mol/L（NH4）2SO4的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液沖洗，以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后以2mL/min的流速將酯酶梯度洗脫至含（NH4）2SO4（0～1mol/L）的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中，總體積超過4個柱體積，收集10mL的餾分。將含有酯酶活性的組分匯集[23]。

采用Superdex G-200柱進行進一步分離。利用含有150 mmol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液洗脫柱子，流速為1 mL/min。收集組分，檢測酯酶活力。所有純化步驟在4℃進行。

1.3.4 分析檢測方法

酯酶活力的測定：參照KORDEL M等[26]的方法測定酯酶活力。取10 mL環(huán)己烷、3.55 mL乙醇、6.25 mL己酸（所有試劑每500 mL中加入30 g無水硫酸鈉）以及0.2 mL酶液，在100mL的密閉錐形瓶中進行酯化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為35℃。反應(yīng)24h后取上清液0.5mL于50mL錐形瓶中，加入5mL水，2滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH滴定至終點，測定己酸的消耗量。酯酶活力單位定義：在測定條件下每分鐘消耗1 μmol己酸所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。

蛋白質(zhì)含量的測定：采用Bradford法[27]。

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定：采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（12%丙烯酰胺）進行測定[28]。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

采用SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離純化酯酶后，回收蛋白條帶，用胰蛋白酶裂解得到肽混合物。采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過檢測器收集分離的離子，并測定每個離子的質(zhì)子數(shù)與電荷數(shù)的比值（m/z值），從而獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析結(jié)果。

1.3.6 蛋白質(zhì)N端測序

采用SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離0.5nmol的純化酯酶，并用電印跡法將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidencefluoride，PVDF）上。從CBB-R250染色的PVDF印跡中切下酯酶條帶，利用蛋白測序儀建立標準氨基酸圖譜，確定純化的非變性酯酶的N-末端序列。

1.3.7 酯酶酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）溫度對酯酶活性和穩(wěn)定性的影響

將純化得到的酯酶加入到酯化反應(yīng)體系中，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃條件下進行酯化反應(yīng)，測定酯酶活力。以酶活力最大值為100%，計算相對酶活。

將酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下水浴60 min，每隔10 min取樣在37℃條件下進行酯化反應(yīng)，測定剩余酯酶活力，并以未保溫時的酶活力為100%，計算相對酶活。

（2）pH值對酯酶活性和穩(wěn)定性的影響

分別用pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.25 mol/L）、pH 5.0、6.0、7.0的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液（0.25 mol/L）及pH 7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl緩沖液（0.25 mol/L）配制底物反應(yīng)液，測定其酯酶活力，并以酶活力最大值設(shè)定為100%，計算相對酶活。

將酶液分別置于上述對應(yīng)的pH緩沖液中于4℃放置過夜，測定剩余酶活力，以pH7.2處理下的酯酶酶活力（100%）作為對照，計算相對酶活。

（3）金屬離子對酯酶活性的影響

在溶解酯酶的10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖溶液中分別添加Ca2+（CaCl2）、Mg2+（MgSO4·7H2O）、Mn2+（MnCl2）、Zn2+（ZnSO4·7H2O）、Cu2+（CuSO4·7H2O）、Fe2+（FeSO4·7H2O）等二價金屬離子至終濃度為5mmol/L，測定酯酶活力，以不加金屬離子的酯酶酶活為100%，并計算相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分子生物學(xué)鑒定

在黃山頭酒廠的紅心大曲中分離出一株產(chǎn)酯酶的紅曲霉菌株，編號為HQ-1，采用分子生物學(xué)對其進行菌種鑒定，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由圖1可知，菌株HQ與Monascus purpureusMp-41聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，確定該菌株HQ為一株紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。

圖1 菌株HQ的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain HQ

2.2 發(fā)酵時間對酯酶活性的影響

紫色紅曲霉HQ發(fā)酵過程中酯酶活性和菌體干質(zhì)量的變化如圖2所示。

圖2 紫色紅曲霉HQ發(fā)酵過程中酯酶活力和菌體干質(zhì)量隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律Fig.2 Changes of esterase activity and dry weight of mycelia of Monascus purpureusHQ with culture time during fermentation process

由圖2可知，菌株HQ在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)46 h后，菌株HQ進入快速生長期，細胞生長量快速增加，96 h達到穩(wěn)定期，生長110 h后，細胞生長量開始減少，進入衰亡期。發(fā)酵液中的酯酶活力隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，72 h時達到最大值（5.8 U/mL），繼續(xù)培養(yǎng)酯酶活力開始下降，96 h時達到4.8 U/mL。

2.3 胞外酯酶的分離純化

兩步硫酸銨沉淀法中硫酸銨濃度與酯酶活性的對應(yīng)關(guān)系見圖3。

由圖3A可知，當硫酸銨飽和濃度為50%時，殘留酯酶活性最高，為7.82 U/mL。因此，在第一沉淀步驟中選擇50%硫酸銨飽和濃度。由圖3B可知，經(jīng)50%飽和硫酸銨處理后的粗酶液，再次添加硫酸銨，硫酸銨飽和濃度達到80%時，酯酶活力最大，為10.53 U/mL，飽和度＞80%之后，酯酶活力急劇減小。因此在第二次沉淀步驟中選擇硫酸銨飽和度為80%。

圖3 兩次硫酸銨鹽析沉淀的硫酸銨飽和濃度與酯酶活力的對應(yīng)關(guān)系Fig.3 Correspondence relationship between ammonium sulfate saturation of ammonium sulfate two-stage precipitation and esterase enzyme activity

二步飽和硫酸銨鹽析處理得到的沉淀用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶解，加入到丁基瓊脂糖柱中，以含不同濃度硫酸銨的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）緩沖液梯度洗脫，將具有最大酯酶活力的組分收集合并，然后利用Superdex G-200柱純化，純化后進行SDS-PAGE（12%丙烯酰胺），結(jié)果如圖4所示。

圖4 SDS-PAGE圖Fig.4 Electrophoretogram of SDS-PAGE

由圖4可知，經(jīng)二步飽和硫酸銨鹽析、丁基瓊脂糖凝膠柱和Superdex G-200柱純化，酯酶經(jīng)SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離后顯示出單一的蛋白條帶，表明該蛋白具有高純度，且其分子質(zhì)量為60 kDa，命名該蛋白質(zhì)為ESM1。酯酶ESM1的純化結(jié)果見表1。

表1 肽段序列比對結(jié)果Table 1 Comparison results of peptide sequence

由表1可知，經(jīng)二步硫酸銨沉淀和丁基瓊脂糖凝膠柱純化后，檢測到的總蛋白含量為0.59 mg，經(jīng)過Superdex G-200柱純化后，最終獲得的酶蛋白含量為0.06mg。200mL粗酶液經(jīng)純化后大約能獲得0.06 mg的純酯酶蛋白。

2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

通過MALDI-TOF-MS分析，獲得酯酶ESM1的肽質(zhì)量指紋圖譜，結(jié)果如圖5所示。酯酶ESM1的肽段序列比對結(jié)果見表2。

圖5 酯酶ESM1的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrogram of esterase ESM1

表2 肽段序列比對結(jié)果Table 2 Comparison results of peptide sequence

注：OS代表物種名；GN代表在Genbank中名字；PE代表蛋白質(zhì)存在（后面數(shù)字代表蛋白質(zhì)存在的個數(shù)）；SV代表序列版本。

由表2可知，在NCBI中經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，在紅曲中有一種酸性蛋白質(zhì)與篩選得到的蛋白質(zhì)匹配得分最高為199分。純化得到的酯化酶分子質(zhì)量在60 kDa，而最高得分的酸性蛋白質(zhì)只有41 kDa，可以說明純化得到的蛋白質(zhì)包含有一部分酸性蛋白質(zhì)的肽段序列。

2.5 酯酶N-末端氨基酸序列分析

使用蛋白質(zhì)測序儀檢測純酯酶ESM1的前10個N-末端氨基酸殘基序列，N-末端氨基酸殘基序列為AOPEEDAAND。通過氨基酸殘基比對發(fā)現(xiàn)，該酯酶與其他真菌菌株的酯酶無同源性。

2.6 酯酶ESM1酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.6.1 酯化溫度對酯酶活性及穩(wěn)定性的影響

酯化溫度對酯酶ESM1活性及穩(wěn)定性的影響如圖6所示。

圖6 溫度對酯酶ESM1活性（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity(a)and stability(b)of esterase ESM1

由圖6a可知，酯酶ESM1的最適溫度為60℃。當溫度＜60℃時，酶活性隨溫度的升高而增加；溫度＞65℃之后，酶活性急劇下降。由圖6b可知，在30℃條件下水浴60min內(nèi)，酯酶活性變化不顯著（P＞0.05），因此酯酶ESM1在30℃時具有較好的穩(wěn)定性；當溫度升高至50℃時，酯酶ESM1活性隨水浴時間的延長而降低，40min后趨于穩(wěn)定，相對酶活為60%；溫度達到60℃時，酯酶ESM1的半衰期為15 min；水浴溫度達到70℃時，水浴8min后相對酶活＜50%，隨后，隨著水浴時間的延長，酯酶活性迅速下降，70℃時酯酶半衰期為8min。

2.6.2 pH值對酯酶活性和穩(wěn)定性的影響

pH對酯酶ESM1活性及穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對酯酶ESM1活性（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.7 Effect of pH on the activity(a)and stability(b)of esterase ESM1

由圖7a可知，當反應(yīng)體系的pH值為4.0時，相對酶活僅為10%，說明在該pH條件下酯酶ESM1活性受到抑制；隨著pH的升高，酯酶ESM1活性在pH值為7.0時達到最大值；在pH值為7.5時，酯酶活性略有下降；當pH＞7.5之后，酯酶ESM1活性急劇下降，表明ESM1在中性條件下具有較高的活性。由圖7b可知，當pH值為4.0時，酯酶ESM1相對酶活最低，為8%，表現(xiàn)出對強酸的不耐受性；隨著pH值的增加，酯酶活性逐步升高，pH值為7.0時酯酶ESM1相對酶活達到最大，且表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。隨著pH的進一步升高，酯酶活性下降，在pH為9.0時，酯酶ESM1活性最低。

2.6.3 金屬離子對酯酶ESM1活性的影響

不同金屬離子對酯酶ESM1活性的影響結(jié)果見圖8。

圖8 金屬離子對酯酶ESM1活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of esterase ESM1

由圖8可知，Zn2+、Ca2+和Na+對酯酶ESM1活力有促進作用，其中Zn2+促進作用最高，而Cu2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+對酯酶ESM1活力有抑制作用，其中Cu2+表現(xiàn)出較強的抑制作用，抑制60%的酯酶活力，分析原因可能是由于Cu2+影響底物與酯酶的催化活性中心結(jié)合，使酯酶利用底物效率降低。Mg2+、Fe2+、Mn2+分別表現(xiàn)出97%、86%、70%、98%的抑制。

3 結(jié)論

本研究從白酒高溫大曲中篩選出一株產(chǎn)酯酶的菌株HQ，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為紫紅曲霉（Monascus purpureus）。從M.purpureus的液體發(fā)酵液中分離純化得到高活性酯酶，命名為ESM1。經(jīng)質(zhì)譜分析和N端測序發(fā)現(xiàn)，純化后的酯酶分子量為60 kDa，具有酸性蛋白酶序列，是一種尚未報道的新型酯酶。ESM1酶學(xué)性質(zhì)研究表明，ESM1在60℃、pH 7.0條件下具有良好的酯化能力，在溫度為50℃的環(huán)境和中性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，Zn2+有助于提高酯酶ESM1的活性，而Cu2+抑制ESM1的活性。紫色紅曲霉為傳統(tǒng)發(fā)酵白酒生產(chǎn)中的菌種選擇、優(yōu)化或酶的直接添加提供了基礎(chǔ)，同時也為生產(chǎn)更優(yōu)質(zhì)的白酒提供了可能。