梁光杰，車程川，鞏志金，楊 革*

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

放線菌（Streptomycessp.）屬于革蘭氏陽性菌，能夠產(chǎn)生具有經(jīng)濟(jì)意義的次級代謝產(chǎn)物和其他具有藥物意義的化合物，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的70%天然抗生素產(chǎn)自放線菌[1]，因此被認(rèn)為是重要的微生物[2-4]。近幾十年來，從陸地分離到大量放線菌菌株[5-7]，但是從陸地上發(fā)現(xiàn)新的放線菌菌株以及新穎的化合物變得越來越困難，所以人們把目光轉(zhuǎn)向海洋。海洋放線菌需要適應(yīng)極端的海洋環(huán)境，所以形成了不同于陸生放線菌的獨(dú)特、復(fù)雜的代謝途徑。因此產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類型和生物活性方面呈現(xiàn)出多樣性和新穎性[8]。ZOBELL C E[9]研究發(fā)現(xiàn)，海水具有殺菌的能力，隨后世界各國加大對海洋微生物資源開發(fā)的力度。研究發(fā)現(xiàn)，大約27%種屬的海洋微生物次級代謝產(chǎn)物具有抗菌活性的潛力[10]，其中放線菌的活性次級代謝產(chǎn)物約占微生物來源的活性次級代謝產(chǎn)物的45%，海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)和研究為生產(chǎn)新的抗生素開創(chuàng)了新的途徑[11]。微囊化技術(shù)、噬菌體定向篩選等新技術(shù)廣泛的應(yīng)用使海洋放線菌研究得到飛速的進(jìn)展[12]。目前為止，對海洋放線菌及其次級代謝產(chǎn)物研究報道很多[13-16]。這些新化合物具有新穎的結(jié)構(gòu)、良好的生物活性，如抑制腫瘤生長[17]、抑制真菌生長[18]、拮抗瘧疾[19]以及殺蟲的潛力[20-21]。因此，從海洋環(huán)境中分離純化放線菌，對研究海洋放線菌種類的多樣性及其次級代謝活性物質(zhì)具有重大意義[22]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）和變形桿菌（Proteus）是常見的致病菌。因此選擇這3種廣泛存在菌株作為指示菌用于海洋放線菌的篩選，以達(dá)到尋找新型海洋抗生素的目的。

海洋灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）F8由本實驗室分離于日照海岸線，通過研究影響其抑菌活性的培養(yǎng)條件，優(yōu)化了其發(fā)酵條件。通過探究其發(fā)酵產(chǎn)物的性質(zhì)并對抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了粗提，并對粗提物進(jìn)行了最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的探究，為以后抑菌活性物質(zhì)進(jìn)一步的分離純化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）F8：由本實驗室分離鑒定并保存到中國微生物菌種保藏管理中心，專利菌種保藏專利號為CGMCC NO.14923。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）CGMCC 1.183、變形桿菌（Proteus）CGMCC 1.491：均為本實驗保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、可溶性淀粉、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鎂（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麥芽浸粉（生化試劑）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；AB-8大孔吸附樹脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鈉型732陽離子交換樹脂：北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠G25：美國GE公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌株F8活化培養(yǎng)基采用麥芽浸粉（yeast extract-malt extract-glucose，YMG）培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g，葡萄糖4 g，麥芽浸粉10 g，自然海水1 L，pH 7.0～7.5，115 ℃滅菌30 min。

菌株F8發(fā)酵培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO31 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，自然海水1 L，121 ℃滅菌20 min。

指示菌生長培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-3CpH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；Lab-Therm LT-X振蕩培養(yǎng)箱：比歐科技國際發(fā)展有限公司；HP PLUS 10D全自動蛋白純化系統(tǒng)：利穗科技（蘇州）有限公司；1-14小型臺式離心機(jī)、3-18KS高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司；Alpha 1-2LD plus冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將菌株F8從甘油管中取出，接種于固體YMG培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)7 d。

1.3.2 種子液的制備

將活化好的菌株接種于液體高氏一號培養(yǎng)基中180r/min、28℃條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d。

1.3.3 抑菌活性的測定

將菌株F8進(jìn)行發(fā)酵（初始pH值7，28℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵7 d），然后發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行抑菌活性測試。使用牛津杯法測定抑菌活性：吸取0.2mL指示菌菌液到LB平板表面，用涂布棒將菌液涂布均勻，在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯（內(nèi)徑6 mm），輕輕安放，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入0.2mL發(fā)酵液。然后將平板于37℃條件下培養(yǎng)24h，之后測量透明圈直徑（透明圈＞6mm，說明具有抑菌作用）。

1.3.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

培養(yǎng)時間對菌株F8抑菌效果的影響：在發(fā)酵溫度為28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)，分別在第5～12天每天測定發(fā)酵液抑菌效果，每組做3個平行。

接種量對菌株F8抑菌效果的影響：在發(fā)酵溫度為28℃，接種量分別為5%、6%、7%、8%、9%、10%，180 r/min搖瓶培養(yǎng)11 d，測定發(fā)酵液抑菌活性，每組做3個平行。

發(fā)酵溫度對菌株F8抑菌效果的影響：在接種量為8%，發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃條件下，180 r/min搖瓶培養(yǎng)11 d，測定發(fā)酵液抑菌活性，每組做3個平行。

發(fā)酵液的初始pH對菌株F8抑菌效果的影響：在接種量為8%，發(fā)酵溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH分別為5、6、7、8、9條件下，180 r/min搖瓶培養(yǎng)11 d，測定發(fā)酵液抑菌活性，每組做3個平行。

1.3.5 抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

pH穩(wěn)定性：將發(fā)酵液上清（10 000 r/min離心10 min）pH調(diào)節(jié)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12放置1 h，然后再將pH調(diào)回到原發(fā)酵液pH，分別測定抑菌活性，每組做3個平行，以原發(fā)酵液作為對照。

熱穩(wěn)定性：將發(fā)酵液上清分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下水浴30 min，分別測定抑菌活性，每組做3個平行，以原發(fā)酵液作為對照。

光照穩(wěn)定性：將發(fā)酵液上清置于光照條件下照射1～10 d，然后測定抑菌活性，以原發(fā)酵液作為對照。

遺傳穩(wěn)定性：將菌株F8在高氏一號固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代8代，然后每代分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵（發(fā)酵液初始pH值為8，接種量8%，30℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵11 d），測定各代發(fā)酵液上清的抑菌效果。

1.3.6 抑菌物質(zhì)的分離純化

將10 L發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min取上清，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到發(fā)酵液浸膏，然后用盡量少的水溶解浸膏經(jīng)過AB-8大孔樹脂層析，用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%及100%的甲醇溶液梯度洗脫，收集甲醇流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后過鈉型732陽離子交換樹脂收集流出液，將流出液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，將2.5 g濃縮樣品溶于2 mL超純水中，經(jīng)葡聚糖凝膠G25柱層析得到抑菌活性物質(zhì)粗提物。

1.3.7 粗提物最小抑菌濃度的測定

制備菌液：將指示菌預(yù)先活化兩代后再接種到液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)6～8 h，作為測試菌菌液。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：配制不同濃度的發(fā)酵液粗提物于試管中，在含不同濃度的粗提物試管中，各加入測試菌0.2 mL，充分混勻。另作兩個對照管（只含菌和只含粗提物）。將上述試管置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。取出試管，充分振蕩，用肉眼逐個觀察各試管的渾濁度。如某管培養(yǎng)液與對照管（只含粗提物的試管）同樣透明，則表明測試菌的生長被抑制，因此該管的粗提物量即為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

圖1 不同培養(yǎng)時間對菌株F8抑菌活性的影響Fig.1 Effect of different culture time on antibacterial activity of strain F8

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間在5～11 d范圍內(nèi)增加，發(fā)酵液對3種指示菌的抑制作用越來越強(qiáng)，說明隨著培養(yǎng)時間的增加產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)越來越多；當(dāng)培養(yǎng)時間到第11天時抑菌作用達(dá)到最大，對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為19 mm、29 mm、28 mm；當(dāng)培養(yǎng)時間超過11d時，抑菌效果減小，原因可能是當(dāng)培養(yǎng)天數(shù)超過一定值時，抑菌活性物質(zhì)所處的發(fā)酵環(huán)境發(fā)生了變化導(dǎo)致活性物質(zhì)降解，從而導(dǎo)致抑菌效果減小。因此，最適培養(yǎng)時間為11d。

2.2 接種量對抑菌效果的影響

圖2 不同接種量對菌株F8抑菌活性的影響Fig.2 Effect of different inoculum on antibacterial activity of strain F8

由圖2可知，隨著接種量在5%～8%范圍內(nèi)增加，發(fā)酵液抑菌效果也隨著增加；當(dāng)接種量為8%時抑菌效果達(dá)到最好，對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為20 mm、32 mm、30 mm；當(dāng)接種量＞8%之后，抑菌效果反而減小，原因可能是菌體生長所需要的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)增加而三角瓶內(nèi)的溶氧跟營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足其生長從而降低抑菌活性物質(zhì)的生產(chǎn)使抑菌效果增加不明顯。因此，最適接種量為8%。

2.3 不同發(fā)酵溫度對抑菌效果的影響

圖3 不同培養(yǎng)溫度對菌株F8抑菌活性的影響Fig.3 Effect of different culture temperature on antibacterial activity of strain F8

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在20～30℃范圍內(nèi)升高，發(fā)酵液抑菌效果隨著溫度的增加而增大；當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，發(fā)酵液抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為22 mm、35 mm、32 mm；當(dāng)發(fā)酵溫度高于30℃之后，發(fā)酵液抑菌效果降低，原因是當(dāng)超過最適溫度以后菌株的生長狀況不好，所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)減少從而導(dǎo)致抑菌效果降低。因此，最適發(fā)酵溫度為30℃。

2.4 發(fā)酵液的初始pH對抑菌效果的影響

圖4 不同初始pH值對菌株F8抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different initial pH values on antibacterial activity of strain F8

由圖4可知，隨著初始pH在5～8范圍內(nèi)增加，抑菌效果隨之增加；當(dāng)初始pH值為8時，抑菌效果達(dá)到最好，對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈分別為23 mm、44 mm、34 mm；當(dāng)初始pH值＞8之后，抑菌效果有所下降，原因是過酸或者過堿都不適合生長，所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)減少從而導(dǎo)致抑菌效果下降。因此，最適初始pH值為8。

2.5 抑菌活性物質(zhì)的pH穩(wěn)定性

由表1可知，經(jīng)過不同pH處理菌株F8發(fā)酵產(chǎn)物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結(jié)果表明，抑菌活性物質(zhì)對酸堿有較強(qiáng)的承受能力，pH穩(wěn)定性較好。

表1 菌株F8發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的pH穩(wěn)定性Table 1 pH stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

2.6 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

表2 菌株F8發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的熱穩(wěn)定性Table 2 Thermal stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

由表2可知，經(jīng)過不同溫度處理發(fā)酵產(chǎn)物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結(jié)果表明，菌株F8發(fā)酵所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.7 抑菌活性物質(zhì)的光照穩(wěn)定性

表3 菌株F8發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的光照穩(wěn)定性Table 3 Light stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

續(xù)表

由表3可知，經(jīng)過不同時間的光照處理，發(fā)酵產(chǎn)物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結(jié)果表明，菌株F8發(fā)酵所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)具有很好的光穩(wěn)定性。

2.8 抑菌活性物質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性

表4 菌株F8發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的遺傳穩(wěn)定性Table 4 Genetic stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

由表4可知，不同傳代次數(shù)的菌株進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵液對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.9 抑菌物質(zhì)的分離純化

10 L發(fā)酵液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，AB-8大孔樹脂層析，732陽離子交換樹脂層析，最后經(jīng)葡聚糖凝膠G25層析進(jìn)行分離純化，洗脫曲線見圖5。

圖5 發(fā)酵液組分在G25層析柱分離純化洗脫曲線Fig.5 Elution curve of separation and purification of fermentation liquid components on G25 chromatographic column

由圖5可知，一共洗脫出了4個峰，分別收集這4個峰對應(yīng)的洗脫組分后進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果表明，第3個峰對應(yīng)組分的洗脫液具有抑菌效果。

2.10 最小抑菌濃度

將上述第3個峰洗脫液冷凍干燥后，配制成質(zhì)量濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL、90 μg/mL、100 μg/mL溶液進(jìn)行MIC測試，以只含指示菌和只含粗提物兩支試管為對照，結(jié)果見表5。由表5可知，洗脫組分3對金黃色葡萄球菌的MIC為100 μg/mL，對變形桿菌的MIC為30 μg/mL，對產(chǎn)氣桿菌的MIC為20 μg/mL。

表5 抑菌活性物質(zhì)粗提物對不同測試菌的最小抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of crude extracts of antibacterial active substances on different test bacteria

3 結(jié)論

本實驗對海洋鏈霉菌菌株F8進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化及其抑菌活性物質(zhì)性質(zhì)的研究。通過單因素實驗確定了菌株最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間11 d，接種量8%，培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值為8。優(yōu)化后菌株F8對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的抑菌圈直徑分別為23 mm、44 mm、34mm。對菌株所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)抑菌活性物質(zhì)為水溶性，并且具有較好的酸堿、熱、光照以及遺傳穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上通過AB-8大孔樹脂、鈉型732陽離子交換樹脂以及葡聚糖凝膠G-25層析對抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分析純化，并得到具有抑菌活性的粗提物，其對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌的MIC分別為100 μg/mL、30 μg/mL及20 μg/mL。