丁娟芳，楊 嘉，朱淑云，李文潔，韋林洪*

（1.揚州市職業(yè)大學 生物與化工工程學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 揚州 225111）

亞硝酸鹽在食品中廣泛存在，在蔬菜制品中則更為普遍。蔬菜中的亞硝酸鹽主要由細菌將植物體內(nèi)的硝酸鹽轉化而來，高含量的亞硝酸鹽進入人體后會導致一系列的健康風險[1-4]。

乳酸菌是食品自然發(fā)酵中的常見菌種之一，通常被認為是安全的益生菌[5-6]。相關研究表明，乳酸菌在生長代謝過程中可以降解亞硝酸鹽，從而保證食品安全[7-10]，故從自然發(fā)酵環(huán)境中分離乳酸菌并對其進行研究成為一種趨勢[11]。已報道的亞硝酸鹽降解乳酸菌有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串球菌（Leuconostoc mesenteulides）、啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae）、乳酸糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）等[12]，其降解原理主要體現(xiàn)于代謝過程中產(chǎn)生的乳酸和一系列酶，以及乳酸菌成為優(yōu)勢菌后對其他產(chǎn)亞硝酸鹽雜菌的生長抑制[11]。目前，對于乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究主要集中于產(chǎn)酸和亞硝酸鹽還原酶，而降解機制、基因組學還有待進一步研究，其應用離工業(yè)化生產(chǎn)也還有一定距離[13]。

揚州醬菜素享盛名，擁有著2 100年的悠久歷史，其生產(chǎn)工藝融合了制醬、腌漬等過程，千百年來既有傳承，也有創(chuàng)新[14]。本研究旨在從揚州傳統(tǒng)醬菜中篩選出具有降解亞硝酸鹽活性的優(yōu)良乳酸菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定并研究其性能，為今后進一步研究其降解機理并建立發(fā)酵體系提供良好的菌種資源和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬菜樣品：均為揚州市場銷售的本地散裝醬菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、生化鑒定管：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

乳酸菌篩選培養(yǎng)基：在MRS瓊脂培養(yǎng)基中添加質量濃度為0.2 g/L的碳酸鈣；

亞硝酸根降解篩選培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加質量濃度為100 mg/L的NO2-。

1.1.3 試劑

革蘭氏染色試劑盒：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；KOD FX脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（1.0 U/μL）：日本TOYOBO公司；DNA凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒：美國Axygen公司；碳酸鈣、氫氧化鉀、乙酸、甘油、雙氧水（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸根（NO2-）標準溶液（1 000 μg/mL）、硝酸根（NO3-）標準溶液（1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HVE-50滅菌鍋：日本Hirayama公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ICS1500離子色譜（ion chromatography，IC）儀：美國戴安公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ECLIPSE生物顯微鏡：日本尼康公司；3-30k冷凍臺式高速離心機：德國Sigma公司；752型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；2720PCR擴增儀：美國ABI公司；DYY-8C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；E1617-T130 plus凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Bagmixer400拍擊式均質器：法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取25 g醬菜樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min，制成10-1樣品均液。吸取1 mL 10-1樣品均液注入盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，混合均勻得到10-2樣品均液。重復以上操作制成10-3樣品均液。吸取不同濃度樣品勻液1 mL涂布于無菌平皿內(nèi)，將冷卻至46℃的乳酸菌篩選培養(yǎng)基傾注平皿，混合均勻后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，直到有溶鈣圈的單菌落出現(xiàn)。單菌落經(jīng)純化后進行革蘭氏染色，革蘭氏陽性同時觸酶陰性[15-16]的菌株由保藏珠吸附后加入含50%甘油的MRS肉湯介質中，于-70℃超低溫冰箱中進行保存。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

將活化2代的待測菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，于（36±1）℃條件下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液在無菌條件下2000r/min離心10min，棄去上清液，用10mL生理鹽水振蕩洗滌菌體。重復以上離心、棄上清、洗滌菌體操作2次，在洗滌后的菌體中加10 mL生理鹽水混勻，制成測試菌液。以生理鹽水作為對照，采用分光光度計在波長550 nm處測定測試菌液的光密度OD550nm值，控制其在0.6～0.8范圍內(nèi)。

將測試菌液以5%（V/V）的接種量接種到10 mL亞硝酸根（NO2-）降解篩選培養(yǎng)基中，于（36±1）℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。檢測培養(yǎng)基中的NO2-含量，用降解率來表示菌株降解NO2-的能力，以篩選出有高降解活性的乳酸菌菌株。NO2-含量測定方法參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行測定。NO2-降解率的計算公式如下：

1.3.3 菌種鑒定

（1）形態(tài)觀察和生理生化鑒定

將1.3.2中篩選到的具有降解鹽酸鹽活性的乳酸菌活化2代后接種至MRS瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，對菌株進行形態(tài)觀察。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對乳酸菌進行生理生化特性鑒定[15-16]，碳源利用試驗采用生化鑒定管進行。

（2）分子生物學鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取菌株的基因組[17]，以通用引物對（27f/1492r）對菌株的16SrDNA序列進行擴增。PCR擴增反應體系：2×KOD Buffer 25μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture 10 μL、KOD DNA polymerase 1 μL、引物27f和1492r各1.5 μL、雙蒸水（ddH2O）10 μL、模板1 μL。PCR擴增程序：94 ℃、3 min；98 ℃、10 s，55 ℃、30 s，68 ℃、4 min，30個循環(huán)；68 ℃、2 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行測序。引物及測序結果均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

將菌株的測序結果與美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對搜索，選擇近源菌種的16S rDNA序列用Clustal X進行序列比對，最后采用MEGA 6.06軟件中的鄰接法（neighbour-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析鑒定菌株與已知菌株的同源性。

1.3.4 生長性能的測定

（1）培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

將1.3.2中的測試菌液按5%（V/V）接種量接種至10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃溫度條件下靜置培養(yǎng)48h，以無菌培養(yǎng)基為空白，在波長550 nm處測定吸光度值。

（2）菌株生長曲線的測定

將1.3.2中的測試菌液按5%（V/V）接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，以最適生長溫度培養(yǎng)24 h，每隔3 h取樣，以無菌培養(yǎng)基為空白，測定樣品在波長550 nm處的吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制測試菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

從醬菜樣品中共分離出有溶鈣圈的菌株59株，其中觸酶試驗陰性同時革蘭氏染色陽性的菌株共32株，初步鑒定為乳酸菌[15-16]。將分離出來的菌株接種到含的MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后用離子色譜檢測培養(yǎng)基中的含量并計算其降解率，結果如表1所示。

由圖1可以看出，取培養(yǎng)12h的菌株DGJ-17的培養(yǎng)液進行分析，在標準物質的保留時間出現(xiàn)了對應的色譜峰，推測在培養(yǎng)過程中有的產(chǎn)生。張慶芳等[18]的研究表明，在發(fā)酵初期，發(fā)酵液pH值為4.5～6.5時，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解主要是由于乳酸菌產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶進行的酶降解；而在pH值＜4.0之前，亞硝酸鹽的降解主要是由于乳酸菌代謝產(chǎn)酸，通過化學反應將轉變?yōu)镹O3-[19]，這也可能是DGJ-17培養(yǎng)液中出現(xiàn)的原因。

表1 乳酸菌培養(yǎng)24 h后NO2-降解率Table 1 Degradation rate of NO2-by lactic acid bacteria cultured for 24 h

圖1 NO2-及NO3-的檢測離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of NO2-and NO3-analysis

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落及細胞形態(tài)結果見圖2。

圖2 菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）和細胞形態(tài)（B）Fig.2 Colonial(A)and cell(B)morphology of strain DGJ-17 on MRS agar medium

由圖2A可以看出，菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落為乳白色球形，表面光滑、邊緣整齊、中央凸起，菌落直徑多為0.2～0.8mm。由圖2B可知，菌株為革蘭氏陽性菌，油鏡下細胞呈現(xiàn)圓球形，單細胞直徑為0.8～1.3 μm，多數(shù)成對，部分呈單個或短鏈狀。

2.2.2 生理生化鑒定

將菌株DGJ-17活化后接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24 h厭氧培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)菌株生長良好，由此說明該菌為兼性厭氧菌。菌株DGJ-17的生理生化試驗結果見表2。

由表2可知，菌株DGJ-17在10℃、45℃和6.5%NaCl條件下均可以正常生長，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》并結合菌株DGJ-17的形態(tài)及生理生化特性可初步確定菌株DGJ-17為腸球菌屬（Enterococcus）。

表2 菌株DGJ-17的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DGJ-17

2.2.3 分子生物學鑒定

將菌株DGJ-17的16SrDNA序列結果在NCBI進行Blast相似性比對，選取同源性較高的腸球菌屬乳酸菌，以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。

圖3 菌株DGJ-17的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain DGJ-17 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株DGJ-17與乳酸腸球菌（Enterococcus lactis）聚于一支，親緣關系最近，同源性達到99%。結合該菌株形態(tài)特點和生理生化特征，將菌株DGJ-17鑒定為乳酸腸球菌（Enterococcus lactis）。

2.3 生長性能測定結果

2.3.1 培養(yǎng)溫度對菌株DGJ-17生長的影響

測定不同培養(yǎng)溫度下菌株DGJ-17的生長情況，結果如圖4所示。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌株DGJ-17生長的影響Fig.4 Effect of different culture temperature on growth of strainDGJ-17

由圖4可知，菌株DGJ-17在15～45℃的溫度范圍內(nèi)均能生長，30℃培養(yǎng)時，菌體密度達到最高（OD550nm=1.4），故30℃為菌株的最適生長溫度。

2.3.2 菌株DGJ-17的生長曲線

菌株DGJ-17在30℃培養(yǎng)條件的生長曲線見圖5。

圖5 30℃條件下菌株DGJ-17的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain DGJ-17 at 30℃

由圖5可以看出，菌株DGJ-17的生長遲緩期為0～12 h，對數(shù)生長期為12～30h，平穩(wěn)期為30～48h，菌體在培養(yǎng)48h后逐步進入衰退期。

3 結論

本實驗從揚州醬菜中篩選到一株能降解亞硝酸鹽的高活性乳酸菌DGJ-17，其NO2-降解率為91.7%，菌株經(jīng)形態(tài)學、生理生化和16S rDNA序列分析被鑒定為乳酸腸球菌（Enterococcuslactis）。菌株DGJ-17的最適生長溫度為30℃，生長遲緩期、對數(shù)期、平穩(wěn)期分別為0～12 h、12～30 h、30～48 h，培養(yǎng)48 h后逐步進入衰退期。本實驗對乳酸腸球菌DGJ-17的后期應用提供了一定的理論依據(jù)，其降解機理及在食品領域的應用還有待進一步研究。