王楨昌，何榮榮，鐘秋平*

（海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

荔枝（Litchi chinensis）因其果肉柔嫩，含較高糖分、適量有機(jī)酸以及多種氨基酸，適合釀制荔枝果酒[1-2]。荔枝汁含有多酚類、黃酮醇、黃烷醇、花色苷等多種功能性成分[3]，在荔枝酒制備過程中經(jīng)過復(fù)雜的加工處理破壞嚴(yán)重，導(dǎo)致荔枝酒產(chǎn)品特性不強(qiáng)、檔次低[4-6]。2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4（H）-pyran-4-one，DDMP）是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在荔枝酒釀制過程中同步代謝過量醋酸時(shí)新發(fā)現(xiàn)的一種通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的帶有焦糖風(fēng)味的香氣成分，具有極強(qiáng)抗氧化活性及生理活性[7-9]。據(jù)現(xiàn)有關(guān)于荔枝酒香氣成分文獻(xiàn)報(bào)道看，荔枝酒的香氣成分包括醇類化合物、酸類化合物、酯類化合物、羰基化合物和苯環(huán)衍生物、萜烯類化合物、含硫化合物、醛類化合物及烴類化合物等[4]，在眾多檢出的香氣化合物中，均未見DDMP。關(guān)于DDMP的研究，國內(nèi)外的報(bào)道主要集中在還原糖-氨基酸體系高溫下進(jìn)行美拉德反應(yīng)及一些高溫?zé)峒庸さ氖称穂10-18]，而關(guān)于荔枝酒制備過程中DDMP生成的適宜條件及變化規(guī)律尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以荔枝汁為發(fā)酵基質(zhì)，探討荔枝酒發(fā)酵制備中DDMP生成的適宜條件及變化規(guī)律，為荔枝酒中DDMP的生成調(diào)控提供理論及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金澄無核荔枝：市售。

果膠酶（多聚半乳糖醛酸酶79%、果膠酯酶18%、果膠裂解酶3%）：法國rue des Briquetiers公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10、QA23、EC1118、R2、D254：上海杰兔工貿(mào)有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-200型組織搗碎機(jī)：上海壘固儀器有限公司；HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；ILRH-250A型生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司；AR124CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16-WS型高速離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PAL-1型手持糖度計(jì)：日本ATAGO公司；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；1260型液相色譜儀及6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝汁的制備

新鮮荔枝去皮、去核，打漿，添加0.25 g/kg果漿質(zhì)量的果膠酶，40℃水解120 min，4 000 r/min離心20 min，得澄清荔枝汁，接種前添加200 mg/L的焦亞硫酸鈉。

1.3.2 DDMP生成條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

不同酵母對(duì)DDMP生成的影響：將制備好的荔枝汁，接入活化好的釀酒酵母DV10、QA23、EC1118、R2、D254，在20℃的溫度條件下恒溫發(fā)酵至質(zhì)量恒定，探討不同酵母對(duì)DDMP形成的影響。

發(fā)酵溫度對(duì)DDMP形成的影響：將制備好的荔枝汁，接入活化好的釀酒酵母DV10，分別在15℃、20℃、25℃、30℃條件下恒溫發(fā)酵至質(zhì)量恒定，探討發(fā)酵溫度對(duì)DDMP形成的影響。

起始pH對(duì)DDMP形成的影響：將制備好的荔枝汁，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、3.5、4.0、4.5，接入活化好的釀酒酵母DV10，在20℃條件下恒溫發(fā)酵至質(zhì)量恒定，探討起始pH對(duì)DDMP生成的影響。

發(fā)酵過程中DDMP的變化：將制備好的荔枝汁，接入活化好的釀酒酵母DV10，在20℃條件下恒溫發(fā)酵，分別在發(fā)酵的第3天、第6天、第9天、第12天及第15天時(shí)取樣檢測(cè)DDMP的含量，探討不同發(fā)酵時(shí)間DDMP的變化。

熱處理及陳釀期間DDMP的變化：后酵完成后對(duì)荔枝酒進(jìn)行熱處理，在60℃條件下陳釀，分別在第10天、第30天、第60天、第90天及第120天時(shí)取樣測(cè)定DDMP的含量，以室溫陳釀的酒樣為對(duì)照，考察陳釀期間DDMP的變化。

1.3.3 DDMP生成條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定酵母為DV10、發(fā)酵溫度20℃和陳釀溫度60℃，以發(fā)酵起始pH（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和陳釀時(shí)間（C）3個(gè)因素為自變量，DDMP含量（Y）為響應(yīng)值，因素與水平見表1。

表1 DDMP生成條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for DDMP production condition optimization

1.3.4 測(cè)定方法

采用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定DDMP含量，AB-INowax彈性石英毛細(xì)管柱（30.0m×250μm×0.25μm）。柱溫45℃（保留2min），以4℃/min升溫至230℃，保持20 min；汽化室溫度250℃；載氣：高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓5.08 psi，載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；溶劑延遲時(shí)間1.5 min。

電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增電壓1 618 V；接口溫度280℃；掃描質(zhì)量范圍20～450 amu。

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist2008和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定DDMP成分，用峰面積歸一化法確定DDMP的相對(duì)含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有分析數(shù)據(jù)為各組處理3次重復(fù)的平均值，利用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析（analysisofvariance，ANOVA），各平均值利用Duncan多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同酵母對(duì)DDMP生成的影響

荔枝汁中含有豐富的糖分和氨基酸，特別是利于DDMP生成的葡萄糖和脯氨酸含量較高，具備生成DDMP的物質(zhì)基礎(chǔ)[19-20]。不同酵母發(fā)酵對(duì)荔枝酒DDMP的生成情況見圖1。

圖1 不同釀酒酵母對(duì)DDMP生成的影響Fig.1 Effect of differentSaccharomyces cerevisiaeon DDMP production

由圖1可知，釀酒酵母QA23、EC1118和R2發(fā)酵所得的荔枝酒中DDMP的生成量顯著低于酵母DV10發(fā)酵所得的荔枝酒（P＜0.05），而酵母D254所釀制的荔枝酒中DDMP的含量略低于酵母DV10發(fā)酵的荔枝酒，但兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明釀酒酵母DV最適宜DDMP的生成。DDMP是糖和氨基酸通過羰氨反應(yīng)形成的產(chǎn)物，不同的糖和氨基酸組合對(duì)DDMP的形成有一定影響。不同酵母利用糖和氨基酸的能力各不相同，導(dǎo)致形成DDMP的底物殘留濃度有差異。從5種所測(cè)試的釀酒酵母形成的DDMP含量可知，釀酒酵母DV10可以比較有效的節(jié)約形成DDMP的底物，利于底物形成DDMP，而不是被釀酒酵母作用形成酒精、菌體蛋白及其他代謝產(chǎn)物。因此，選擇釀酒酵母DV10進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)DDMP生成的影響

發(fā)酵溫度對(duì)DDMP形成的影響見圖2。從圖2可以看出，不同發(fā)酵溫度樣品的DDMP含量差異不顯著（P＞0.05），表明發(fā)酵溫度對(duì)DDMP的形成影響較小。溫度是影響美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵因素，在以葡萄糖或果糖與氨基酸組合的高溫固相反應(yīng)體系中，溫度的高低對(duì)DDMP的形成影響顯著，150℃的溫度處理比130℃的溫度更加有利于DDMP的生成[10]。而荔枝酒發(fā)酵是在15～30℃的低溫體系中進(jìn)行的，與130℃及以上的高溫相比，熱力作用小，因而對(duì)DDMP的形成影響小?？紤]到溫度對(duì)釀酒酵母的發(fā)酵速度及荔枝酒風(fēng)味的影響，采用20℃的發(fā)酵溫度較為適宜，此發(fā)酵溫度下DDMP相對(duì)含量為0.077 3%。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)DDMP生成的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on DDMP production

2.1.3 起始pH值對(duì)DDMP生成的影響

起始pH值對(duì)荔枝酒發(fā)酵中DDMP生成的影響見圖3。由圖3可知，起始pH3.5以上的荔枝汁發(fā)酵所得的DDMP含量與pH3.0的相比差異顯著（P＜0.05），但起始pH3.5以上時(shí)樣品間DDMP的生成量差異不顯著（P＞0.05），說明適當(dāng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH可以影響荔枝酒中DDMP的含量?？赡艿脑蚴窃谄鹗紁H＜3.5條件下，較為顯著地抑制了美拉德反應(yīng)過程中葡基胺的形成，導(dǎo)致DDMP生成量的降低。因此選擇起始pH3.5為宜。

圖3 起始pH值對(duì)DDMP生成的影響Fig.3 Effect of initial pH value on DDMP production

2.1.4 發(fā)酵過程中DDMP的變化

發(fā)酵過程中荔枝酒中DDMP變化情況見圖4。從圖4可知，荔枝酒中DDMP的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增加。發(fā)酵9 d后的各酒樣與發(fā)酵第6天、第3天的酒樣之間DDMP的含量差異顯著（P＜0.05）。與高溫短時(shí)條件下的美拉德反應(yīng)相比，低溫條件下的美拉德反應(yīng)發(fā)生緩慢，適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間有利于DDMP的生成。

圖4 荔枝酒發(fā)酵過程中DDMP相對(duì)含量變化Fig.4 Changes of DDMP relative content during lychee wine fermentation

2.1.5 陳釀期間DDMP的變化

室溫陳釀及熱加速陳釀不同時(shí)間內(nèi)DDMP的變化如圖5所示。從圖5可以看出，室溫陳釀期間，DDMP的變化非常緩慢，只有陳釀90 d的酒樣其DDMP的含量與0 d時(shí)相比差異顯著（P＜0.05），其余時(shí)間之間均不顯著（P＞0.05），說明室溫陳釀對(duì)DDMP的影響有限；經(jīng)過60℃溫度處理后，DDMP的含量發(fā)生了顯著變化（P＜0.05），與不經(jīng)熱處理的酒樣相比，只有0 d時(shí)差異不顯著外（P＞0.05），其余陳釀時(shí)間內(nèi)兩者均有顯著差異（P＜0.05），其DDMP的含量隨陳釀時(shí)間的延長逐漸升高，并在陳釀60d時(shí)達(dá)到最大值，隨后略有降低，說明在熱處理?xiàng)l件下陳釀時(shí)間對(duì)荔枝酒中DDMP有顯著影響（P＜0.05）。因此，為了進(jìn)一步提高荔枝酒中DDMP的含量，建議對(duì)荔枝酒進(jìn)行熱加速陳釀時(shí)間60 d為宜。

圖5 不同陳釀時(shí)間對(duì)DDMP生成的影響Fig.5 Effect of different aging time on DDMP production

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

表2 DDMP生成條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for DDMP production conditions optimization

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Experts 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合后得到DDMP含量（Y）與發(fā)酵起始pH值（A），發(fā)酵時(shí)間（B）和陳釀時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=-0.665 8+0.267 6A+0.0352 3B+1.634 5E-003C-2.316 7E-004AC+1.750 0E-005BC-0.030 01A2-1.494 7E-003B2-8.891 7E-006C2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

回歸方程的方差分析見表3，由表3可見，模型（P＜0.0001）極顯著，失擬項(xiàng)（P=0.5487＞0.05），不顯著，決定系數(shù)R2=0.9942，表明該模型相關(guān)性好，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值擬合度較好，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）轉(zhuǎn)低為0.95%，各因素對(duì)DDMP含量影響的次序?yàn)槠鹗紁H值＞陳釀時(shí)間＞發(fā)酵時(shí)間。一次項(xiàng)中起始pH值和陳釀時(shí)間影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵時(shí)間影響不顯著（P＞0.05），表明發(fā)酵起始pH值和陳釀時(shí)間對(duì)DDMP生成的影響大。交互項(xiàng)中AC影響極為顯著（P＜0.01），BC影響顯著，表明發(fā)酵起始pH值和陳釀時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間和陳釀時(shí)間存在交互作用。二次項(xiàng)A2、B2和C2的影響皆為極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 適宜條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Experts 8.0軟件，對(duì)所建立的回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化，得到適宜制備條件為發(fā)酵起始pH4.2，發(fā)酵時(shí)間11.8d，陳釀時(shí)間48.3d，DDMP含量的理論得率0.1483%。為了方便實(shí)際生產(chǎn)，修正為發(fā)酵起始pH4.2，發(fā)酵時(shí)間12 d，陳釀時(shí)間48 d。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得DDMP相對(duì)含量的平均值為0.1512%，與理論值相差1.96%?？梢姡鞴に噮?shù)合理可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

不同釀酒酵母對(duì)荔枝酒中DDMP的含量有顯著影響（P＜0.05），5種釀酒酵母中，DV10最有利于DDMP的生成；發(fā)酵溫度對(duì)DDMP的生成沒有顯著影響（P＞0.05），從荔枝酒的口感及品質(zhì)上考慮，采用20℃的發(fā)酵溫度為宜；發(fā)酵起始pH值和發(fā)酵時(shí)間對(duì)DDMP的生成有影響，發(fā)酵時(shí)間長和較高起始pH的條件下較有利于DDMP的生成；釀制的荔枝酒在室溫條件下陳釀對(duì)DDMP的生成幾乎沒有影響；熱處理有利于DDMP的形成，且在熱處理?xiàng)l件下陳釀時(shí)間對(duì)DDMP的形成有顯著影響（P＜0.05）；通過響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步確定了適宜的發(fā)酵條件為發(fā)酵起始pH4.2、發(fā)酵時(shí)間12d、60℃陳釀時(shí)間48 d，在此條件下得到的DDMP含量為0.151 2%。