江勇，梁子聰，陳其寬，覃建鋒，張慶忠，王恒

（1.黔南布依族苗族自治州中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，貴州 都勻 558000；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，貴州 都勻 558000）

八角楓[Alangium（Lour.）Harms.]又名白龍須、八角金盤等，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版），為貴州地區(qū)苗族特色藥[1]。八角楓廣泛分布于貴州各地，以野生為主，四季皆可采挖，具有祛風(fēng)通絡(luò)、散瘀鎮(zhèn)痛等作用，是當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族治療風(fēng)濕疼痛、關(guān)節(jié)麻木、癱瘓、勞損腰痛、跌打損傷等疾病的常用藥物[1]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種系統(tǒng)性的慢性自身免疫性疾病，其特征是全身多關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)、漸進(jìn)性關(guān)節(jié)軟骨退變及骨破壞。有研究報道稱，以八角楓水煎液熏洗可明顯改善RA患者的臨床癥狀及體征[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）系統(tǒng)與RA發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)節(jié)軟骨退變及骨破壞密切相關(guān)[3]。鑒于此，本研究通過建立Ⅱ型膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，初步探討八角楓水提液對其血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平以及滑膜OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的影響，以期為八角楓治療RA提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ASP300S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉(zhuǎn)式切片機、DM750型光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan GO型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5427R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；DDIL-5型恒溫箱（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Jeldoc2000型凝膠影像分析儀（美國Bio-Rad公司）；TPersonal型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國Biometra公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

八角楓藥材購自貴州中藥材貿(mào)易公司（批號：20120322），由貴陽中醫(yī)學(xué)院胡建山教授鑒定為八角楓[A.（Lour.）Harms.]的干燥細(xì)須根。

雷公藤多苷片（上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z31020415，批號：130301，規(guī)格：10 mg）；弗氏完全佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白（美國Chondrex公司，批號分別為7002、20022）；Trizol試劑盒（美國Invirogen公司，批號：00374923）；SYBR?Select Master Mix預(yù)混液（美國ABI公司，批號：C0521A）；Prime Script 1st Strand cDNASynthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號：RR036A）；OPG、RANKL、RANK、β-肌動蛋白（β-actin）的mRNA引物序列設(shè)計及合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20130305、20130407）；蘇木精-伊紅（HE）染液、乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液、4%多聚甲醛均由黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室提供；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級雄性SD大鼠60只，5周齡，體質(zhì)量140～180 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0003]。所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 八角楓水提液的制備

稱取八角楓藥材適量，烘干、磨粉，加水1 000 mL煎煮3 h，濾過；再加水600 mL煎煮2 h，濾過；合并兩次濾液，濃縮，得質(zhì)量濃度為1 g/mL（按生藥量計）的八角楓水提液。

2.2 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（雷公藤多苷片，10 mg/kg，參照Meeh-Rubner公式[4]換算而得；以蒸餾水為溶劑）和八角楓水提液低、中、高劑量組[5、10、20 g/kg（按生藥量計），參考文獻(xiàn)[5]的半數(shù)致死量（LD50＝20 g/kg）；以蒸餾水為溶劑]，每組10只。取牛Ⅱ型膠原蛋白適量，溶解在0.05 mol/L醋酸溶液中，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的膠原溶液，于4℃下靜置過夜；次日于冰浴條件下，滴加等體積弗氏完全佐劑，充分振蕩乳化后，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的CIA乳劑。除空白組外，其余各組大鼠均于尾根部注射上述CIA乳劑0.1 mL以復(fù)制CIA模型，7 d后同法加強注射1次以延長作用時間[6]。造模后（即第1次注射后，下同）第7天，計算各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI），若AI≥4則表示造模成功[7]。造模后第10天，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。

2.3 一般情況觀察

造模后，觀察并記錄各組大鼠的毛發(fā)、進(jìn)食飲水、活躍度、行為、大小便及體質(zhì)量等情況。

2.4 AI的計算

于造模后第7、10、14、21、28天時按AI評分標(biāo)準(zhǔn)[7]評價各組大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度：關(guān)節(jié)無紅腫計0分，趾關(guān)節(jié)紅腫計1分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹計2分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹計3分，踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹計4分。每個關(guān)節(jié)最高得分為4分，4個關(guān)節(jié)得分之和即為每只大鼠的AI。

2.5 足跖腫脹度的檢測

于造模前及造模后第7、10、14、21、28天時采用排水法以自制足容積測量儀檢測各組大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)記處以下部位的體積（V），考察其足跖腫脹度的變化情況[8]。

2.6 血清中IL-1β、TNF-α水平的檢測

于造模后第28天，斷頭處死各組大鼠，取血適量，以3 000×g離心15 min，留取上層血清，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.7 滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA表達(dá)的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達(dá)情況。取各組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織適量，使用Trizol試劑盒并參照其說明書方法提取組織中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照其說明書方法獲取互補DNA（cDNA），使用PCR儀進(jìn)行擴增（引物序列見表1），每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR?Select Master Mix預(yù)混液10 μL，無核酶水8 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、染膠后，于紫外燈下拍照，使用凝膠影像分析儀進(jìn)行光密度掃描，以目標(biāo)基因與內(nèi)參基因（β-actin）的光密度比值來表示目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)量。

2.8 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

取各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)組織適量，經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定2 d、EDTA脫鈣液中脫鈣10 d后，用大量水清洗，經(jīng)乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為80%、95%、100%）梯度脫水、石蠟包埋、切片（厚度5 μm）后，行HE染色，以中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病變情況。

表1 RT-PCR引物Tab 1 RT-PCR primer

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk法作正態(tài)性檢驗，Levene法作方差齊性檢驗。符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的一般情況

八角楓水提液高劑量組有3只大鼠死亡，陽性組和八角楓水提液中劑量組各有1只大鼠造模失敗，其余大鼠均造模成功。造模后第7天，除空白組外的其余各組大鼠足部均出現(xiàn)綠豆大小的潰瘍，并逐漸結(jié)痂愈合；造模后第12天，除空白組外的其余各組大鼠足趾均皮膚發(fā)紅、發(fā)熱，輕度腫脹；造模后第14天，除空白組外的其余各組大鼠足底及踝關(guān)節(jié)均腫脹明顯，關(guān)節(jié)僵硬，活動量減少，飲食減少，毛發(fā)失去光澤，體質(zhì)量增長較空白組緩慢，部分大鼠見稀便；造模后第21天，除空白組外的其余各組大鼠足底及踝關(guān)節(jié)腫脹程度均較模型組明顯減輕，活動及飲食量有所增加，體質(zhì)量逐漸增加。

3.2 各組大鼠AI比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠AI均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。造模后第28天，陽性組和八角楓水提液各劑量組大鼠AI均較模型組顯著降低，且八角楓水提液高劑量組顯著低于陽性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余時間點各給藥組大鼠AI與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠AI比較（x±s，分）Tab 2 Comparison of AI of rats in each group（x±s，score）

3.3 各組大鼠足跖腫脹度比較

造模后第7天，模型組和各給藥組大鼠足跖腫脹度均較空白組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；上述各組大鼠足跖腫脹度大多于造模后第14天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。造模后第21、28天，各給藥組大鼠足跖腫脹度均較模型組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠足跖腫脹度比較（x±s，mL）Tab 3 Comparison of plantar swelling degree of rats in each group（x±s，mL）

3.4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平均顯著下降，且八角楓水提液高劑量組大鼠血清中IL-1β水平顯著低于陽性組，陽性組和八角楓水提液高劑量組大鼠血清中TNF-α水平均顯著低于其低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其余各給藥組組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（x±s，ng/mL）Tab 4 Comparison of the serum levels of IL-1β and TNF-α of rats in each group（x±s，ng/mL）

3.5 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達(dá)量比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠滑膜組織中OPG mRNA的表達(dá)量均顯著降低，RANKL、RANK mRNA的表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織中OPG mRNA的表達(dá)量均顯著升高，RANKL、RANK mRNA的表達(dá)量均顯著降低，且八角楓水提液高劑量組大鼠滑膜組織中RANKL mRNA以及其中、高劑量組大鼠滑膜組織中RANK mRNA的表達(dá)量均顯著低于陽性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖1、表5。

圖1 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA表達(dá)的電泳圖Fig 1 Electrophorograms of mRNA expression of OPG，RANKL and RANK in synovium of rats in each group

表5 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達(dá)量比較（x±s）Tab 5 Comparison of mRNA expression amount of OPG，RANKL and RANK in synovium of rats in each group（x±s）

3.6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病變情況

空白組大鼠踝關(guān)節(jié)表面光滑，滑膜細(xì)胞無增生，周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)軟骨退變，局部可見骨質(zhì)破壞，滑膜表面粗糙，滑膜細(xì)胞增生、層次紊亂，滑膜及周圍軟組織可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤為主，可見豐富的血管翳形成，纖維母細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增生活躍。與模型組比較，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變、骨破壞及滑膜細(xì)胞增生明顯減輕，血管翳形成較少，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，僅見少量纖維母細(xì)胞及脂肪細(xì)胞增生，詳見圖2。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察顯微圖（HE染色，×200）Fig 2 Micrographs of pathological observation in ankle joint of rats in each group（HE staining，×200）

4 討論

RA的病因十分復(fù)雜，發(fā)病機制尚不明確，其主要病理特征為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨進(jìn)行性退變和破壞，常表現(xiàn)出全身多關(guān)節(jié)腫痛、變形、功能障礙等臨床癥狀[9]。RA屬中醫(yī)“痹癥”范疇，又稱“鶴膝風(fēng)”“歷節(jié)風(fēng)”等，中醫(yī)認(rèn)為其是由內(nèi)、外因相合所致，其中稟賦不足、勞逸過度、飲食內(nèi)傷等為內(nèi)因，風(fēng)、寒、濕、熱等邪氣侵襲為外因[10]?！端貑枴け哉摗分刑岬剑骸帮嬍匙员?、脾胃乃傷……淫氣憂思，痹聚在心”“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也”，闡釋了RA內(nèi)外病因相合而為“痹”的觀點[11]。在以往的中醫(yī)臨床實踐中，許多中藥（如雷公藤、清風(fēng)藤、馬錢子、豬儉草等）被用以治療RA，獲得了較好的臨床療效，其中雷公藤多苷、青藤堿等中藥單體抗RA的作用機制較為明確，已成為臨床公認(rèn)的治療RA的常用藥物[12]，故本研究選用雷公藤多苷作為陽性對照藥物。

CIA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動物模型的病理特征為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨侵蝕破壞，與RA發(fā)病過程類似[13]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，初次免疫和加強免疫注射CIA乳劑后，模型小鼠會出現(xiàn)Th1/Th2亞群失衡，免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞和B細(xì)胞被活化，并分泌TNF-α、IL-1β、IL-17等炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，抑制OPG合成，刺激滑膜纖維母細(xì)胞增生，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，引起滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨退變及骨破壞等病理學(xué)變化[14]。因此，CIA模型常作為RA病因病機研究的一種可靠的動物模型。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠AI和足跖腫脹度均顯著升高或增加，血清中IL-1β、TNF-α水平以及滑膜組織中RANKL、RANK mRNA的表達(dá)量均顯著升高，滑膜組織中OPG mRNA的表達(dá)量顯著降低；同時，其踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察可見關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)軟骨退變，局部可見骨質(zhì)破壞、滑膜表面粗糙、滑膜細(xì)胞增生，滑膜及周圍軟組織可見大量炎癥細(xì)胞浸潤及豐富血管翳形成，并伴有纖維母細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增生活躍，提示造模成功。

八角楓系八角楓科八角楓屬植物，因其葉有八個角，故名為八角楓，是貴州地區(qū)苗族常用的抗RA藥材之一[15]。相關(guān)臨床研究顯示，以八角楓水煎液熏洗能夠緩解RA患者關(guān)節(jié)疼痛癥狀，并降低其血清中IL-6水平[2，16]。趙堂嬌等[17]應(yīng)用以八角楓為主的中藥復(fù)方治療早期RA患者，臨床有效率可達(dá)91.67%。此外，張威[18]通過熱板法、扭體法、耳腫脹等實驗證實，八角楓水提液具有鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的八角楓水提液均可不同程度地降低大鼠AI，減輕其足跖腫脹度，并對其血清中IL-1β、TNF-α具有明顯的下調(diào)作用。TNF-α、IL-1β是公認(rèn)的參與RA發(fā)病過程的重要致炎因子。其中，TNF-α參與了RA的多種致病機制，包括激活內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放及破骨細(xì)胞活化等，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生，并造成軟骨與骨的漸進(jìn)性破壞；IL-1β能通過激活單核巨噬細(xì)胞以及T細(xì)胞、B細(xì)胞參與RA炎癥過程，同時可抑制關(guān)節(jié)軟骨及骨的修復(fù)[19-20]。兩者共同誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，后者通過與破骨前體細(xì)胞表面的受體RANK結(jié)合來促進(jìn)破骨細(xì)胞生成；而OPG是RANKL的誘騙受體，可抑制RANKL對破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用，RANKL/OPG表達(dá)水平的平衡是影響破骨細(xì)胞分化及其功能的重要調(diào)節(jié)因素[21-22]。因此，調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)可能成為防治RA骨侵蝕的主要措施[23]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性組和八角楓水提液各劑量組大鼠滑膜組織中RANK、RANKL mRNA的表達(dá)量均顯著降低，OPG mRNA的表達(dá)量均顯著升高，且八角楓水提液高劑量組大鼠滑膜組織中RANKL mRNA以及八角楓水提液中、高劑量組大鼠滑膜組織中RANK mRNA的表達(dá)量均顯著低于陽性組。這提示八角楓水提液可通過下調(diào)RANK、RANKL mRNA及上調(diào)OPG mRNA的表達(dá)來發(fā)揮對OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，且其高劑量組的作用強于陽性組。

另外，有臨床研究指出，長期過量服用八角楓可致人死亡[24]。實驗研究也證明，八角楓具有神經(jīng)毒性，可引起實驗動物死亡[25]。在本研究實驗過程中，八角楓高劑量組（20 g/kg）中有3只大鼠死亡，其在灌胃后均出現(xiàn)呼吸減弱、抽搐、四肢癱軟等癥狀；而中劑量組（10 g/kg）和低劑量組（5 g/kg）均無大鼠出現(xiàn)上述癥狀或死亡。這提示與八角楓水提液高劑量組比較，其低、中劑量組的效果差異不大，而安全性更高。但該結(jié)論仍需進(jìn)一步的毒理實驗來證實。

綜上所述，八角楓水提液能夠減輕CIA模型大鼠的炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)軟骨退變及骨破壞，其機制可能與下調(diào)血清IL-1β、TNF-α水平，調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)平衡有關(guān)。但八角楓水提液對其他炎癥因子及信號通路的影響尚需進(jìn)一步探討；此外，八角楓雖可治療RA，但仍有患者誤服致死的案例報道，故其安全用藥劑量有待進(jìn)一步明確，其相關(guān)用藥知識也還需廣泛普及。