任丹君，丁一，丁笑剛，翟文杰，劉文星，劉天龍，李建光

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011；2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710032；3.晉中市第一人民醫(yī)院藥劑科，山西 晉中 030600）

近年來，腦血管疾病已成為危害人類健康的重大疾病之一，其中缺血性腦卒中是人類致殘、致死的重要原因[1]。治療性血管新生在缺血性疾病的發(fā)生、治療及預后中均發(fā)揮著重要的作用，是目前醫(yī)學研究的熱點[2]。血管新生一方面可為缺血區(qū)域提供大量生長因子以增加微血管循環(huán)；另一方面亦可促進神經(jīng)及突觸再生，并為突觸可塑性的調(diào)控提供營養(yǎng)和氧氣，因而被認為是缺血性腦卒中后康復的核心治療策略[3]。相關研究證實，中藥及民族藥在腦缺血性疾病的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用[4-5]。訶子為使君子科植物訶子（Terminalia chebulaRetz.）或絨毛訶子（T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.）的干燥成熟果實。在藏藥經(jīng)典著作《晶珠本草》中，訶子被稱為“藏藥之王”，有“補隆”之效[6]，且藏醫(yī)“補隆養(yǎng)血”與治療性血管新生理論相似[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，訶子提取物具有抗氧化、促進血管新生等作用，已有研究初步證實訶子提取物的腦保護作用[8]。對于訶子有效成分在心腦血管疾病中的研究多集中在其抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等[9-11]作用上，然而其是否能通過促進血管新生這一機制來發(fā)揮腦保護作用卻鮮有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，訶子中多酚類活性成分鞣花酸可改善動脈粥樣硬化[12]；其另一種多酚類活性成分柯里拉京可調(diào)控核因子E2相關因子2（Nrf2）及血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）通路，發(fā)揮抗氧化、抗炎、促血管新生的作用，緩解大鼠腦缺血再灌注損傷[9]?；谝陨媳尘埃狙芯客ㄟ^建立腦缺血再灌注[即大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注]損傷大鼠模型，觀察訶子提取物對模型大鼠腦組織的保護作用，進一步探討其通過調(diào)控VEGF/血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）通路和調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）水平進而抗腦缺血再灌注損傷的可能機制，為訶子提取物用于腦缺血再灌注損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HX-100E型小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；COOLPIX S1型照相機（日本Nikon公司）；Ⅸ71-Dtr/2型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；403756PK5Re型線栓（美國Doccol公司）；037-003型大鼠腦槽（北京華越洋生物科技有限公司）；HM340E型石蠟切片機（德國Zeiss公司）；Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5804R型低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑：16.8 cm）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥材與試劑

訶子粉[購于西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，批號：20150401，規(guī)格：10∶1（生藥質(zhì)量∶訶子粉質(zhì)量）]，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院文愛東教授鑒定為使君子科植物訶子（T.chebulaRetz.）果實的粉末。

VEGF、VEGFR2檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號分別為20151104、EK1525）；NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151109）；異硫氰酸熒光素標記的CD31抗體（FITC-CD31）、藻紅蛋白標記的CD34抗體（PE-CD34）、FITC標記的葡聚糖（FITC-D）（美國Abcam公司，批號分別為2530-1、553729、952964）；牛血清白蛋白（BSA，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，批號：03J10150）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色劑、PE標記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白G（PE-IgG）二抗、FITC標記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白G（FITC-IgG）二抗（美國Sigma公司，批號分別為32016D0、20172537、20171508）；多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）；蘇木精染料（上?；瘜W試劑總廠試劑三廠）；伊紅染料（武漢博士德生物工程有限公司）；10%水合氯醛（空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科配制）；磷酸鹽緩沖液（PBS，空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科配制，pH 7.4）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2012-007]。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為24～26℃，濕度為60%～70%；造模前均禁食、不禁水12 h。

2 方法

2.1 訶子提取物的制備

參考文獻[13]制備訶子提取物。稱取訶子粉適量，用適量60%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液濃縮至約藥材量的一半，再加入等體積的95%乙醇，攪拌均勻，靜置12 h后，濾過，濾渣用60%乙醇洗滌，合并濾液與洗液，減壓回收乙醇，冷凍干燥后即得訶子提取物（每1 g提取物由2 g訶子粉制得），備用。

2.2 MCAO再灌注模型的建立

參照改良Longa線栓法[14-15]復制MCAO再灌注損傷模型。大鼠術(shù)前禁食12 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，以仰臥位固定，沿頸正中線作縱行切口，分離皮下組織，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端，將線栓沿頸總動脈分叉部約4 mm處插入頸總動脈，直至有輕微阻力為止，造成右側(cè)大腦MCAO；缺血1.5 h后，拔出線栓實現(xiàn)再灌注（當大鼠清醒后，出現(xiàn)對側(cè)上肢重于下肢的癱瘓癥狀即視為造模成功）[16]。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余操作同上。

2.3 分組與給藥

將40只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和訶子提取物低、中、高劑量組（20、50、100 mg/kg，以提取物質(zhì)量計，劑量設置參考文獻[17-18]），每組8只。按“2.2”項下方法造模成功2 h后，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物（以生理鹽水為溶劑），假手術(shù)組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.4 外周血內(nèi)皮祖細胞（EPCs）水平的測定

于給藥后1、3、7 d采集大鼠內(nèi)眥靜脈叢血1 mL，以2 000 r/min離心20 min，采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血中的單核細胞層，重懸于適量0.5%BSA中，混勻；依次加入FITC-CD31、PE-CD34抗體（分別為10、2 μL），同時以PE-IgG、FITC-IgG二抗（各10 μL）為陰性對照，振蕩混勻后，于室溫下避光孵育10 min，加入0.5%BSA 2 mL，混勻；以1 500 r/min離心10 min，用0.5%BSA清洗，棄去上清液，將沉淀重懸于適量0.5%BSA中，用流式細胞儀測定各組大鼠外周血中EPCs水平（每20萬個外周血單核細胞中檢出FITC-CD31和PE-CD34雙標記的即被認為是EPCs）。

2.5 神經(jīng)功能學評分

于給藥后7 d采用改良Garcia法[19]對大鼠進行神經(jīng)功能學評分，包括自主運動（0～3分）、鼠籠攀援（1～3分）、前肢對稱性（0～3分）、活動對稱性（0～3分）、觸摸觸須反應（1～3分）、觸摸雙側(cè)軀干反應（1～3分）等6項，總分為18分，分數(shù)越低表明神經(jīng)功能損傷越嚴重。

2.6 腦梗死體積百分比的測定

采用TTC染色法測定各組大鼠的腦梗死體積。經(jīng)神經(jīng)功能學評分后斷頭處死各組大鼠，并將其大腦置于腦槽中，制備冠狀切片（2 mm），置于2%TTC染色劑中，于37℃下避光染色30 min。將染色后的腦組織置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，拍照，采用Image Pro Plus 7.0軟件處理并計算腦梗死體積[正常腦組織染色后呈紅色（非蒼白區(qū)），梗死腦組織因未著色而呈白色（蒼白區(qū)）；腦梗死面積為對側(cè)正常腦組織半球面積與患側(cè)正常腦組織面積的差值，總腦梗死體積為各腦切片梗死面積之和乘以切片厚度（2 mm），腦梗死體積百分比為總腦梗死體積與全腦體積的比值][20]。

2.7 腦組織病理學觀察

取大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm），經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理學變化。

2.8 腦組織梗死區(qū)域微血管密度（MVD）的測定

取大鼠腦組織（處死前已注射FITC-D）置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm），參照Weidner法[21]測定大鼠腦組織梗死區(qū)域的MVD。尋找梗死區(qū)域內(nèi)5個血管密集區(qū)，于200倍熒光倒置顯微鏡下計算該區(qū)域內(nèi)被染成綠色的微血管數(shù)目。每份切片均選取5個高倍視野計數(shù)，取其平均值。

2.9 腦組織梗死區(qū)域微血管新生相關因子的測定

于冰浴中切取大鼠腦組織梗死區(qū)域適量，去除腦膜和血液，加入4℃PBS適量，勻漿約1 min，制成10%腦組織勻漿。勻漿于4℃下、以3 000 r/min離心20 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以全波長酶標儀測定腦組織中VEGF、VEGFR2、NO水平，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗進行正態(tài)性和方差齊性分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠外周血EPCs水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時間點外周血EPCs水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠各時間點外周血EPCs水平均顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且該指標于給藥后3 d達到峰值，給藥后7 d有所下降；而訶子提取物低劑量組大鼠各時間點外周血EPCs水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠外周血EPCs水平比較（x±s，n＝8）Tab 1 Comparison of EPCs levels in peripheral blood of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.2 各組大鼠神經(jīng)功能學評分比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能學評分顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能學評分均顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而訶子提取物低劑量組大鼠神經(jīng)功能學評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能學評分和腦梗死體積百分比比較（x±s，n＝8）Tab 2 Comparison of neurological function scores and the volume percentage of cerebral infarction of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.3 各組大鼠腦梗死體積百分比比較

假手術(shù)組大鼠腦組織中未見梗死區(qū)域，而模型組則可見明顯的梗死區(qū)域，且其腦梗死體積百分比較假手術(shù)組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦梗死區(qū)域明顯縮小，且其腦梗死體積百分比均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而訶子提取物低劑量組大鼠腦梗死區(qū)域雖有所縮小，但其腦梗死體積百分比與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見圖1、表2。鑒于上述結(jié)果，本研究以訶子提取物中、高劑量組大鼠為對象進行后續(xù)的機制研究。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果Fig 1 TTC staining results of cerebral tissue in rats of each group

3.4 各組大鼠腦組織病理學變化情況比較

假手術(shù)組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞及毛細血管形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)明顯的病理學改變；模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域周圍細胞排列較紊亂，部分細胞核固縮、溶解，胞體縮??；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域明顯縮小，壞死細胞明顯減少，詳見圖2。

3.5 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD比較

圖2 各組大鼠腦組織病理學顯微觀察結(jié)果（HE染色，×400）Fig 2 Pathological microscopic observation results of cerebral tissue in rats of each group（HE staining，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD均顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD及VEGF、VEGFR2、NO水平比較（x±s，n＝8）Tab 3Comparison of MVD，VEGF，VEGFR2 and NO levels in cerebral infarction area of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.6 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域VEGF、VEGFR2、NO水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域VEGF、VEGFR2、NO水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠上述指標均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表3。

4 討論

血管新生對缺血區(qū)域腦組織微血管循環(huán)的改善、缺血組織的保護和神經(jīng)功能的恢復均具有重要意義[22]。治療性血管新生與傳統(tǒng)藏醫(yī)“補隆養(yǎng)血”、中醫(yī)“益氣生脈”理論均密切相關[23]。在藏醫(yī)理論中，缺血性腦病為“隆血兩虛”，屬“脈癱”，其治法強調(diào)“血”“隆”“脈”三者結(jié)合，通過“補隆養(yǎng)血”的方法達到治療腦卒中的目的[24]。訶子作為“藏藥之王”，有補隆養(yǎng)血、益氣生脈之功效，由其組成的藏藥方劑三果湯也廣泛應用于心腦血管等疾病的治療[23]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，藏藥方劑三果湯[25-26]及訶子提取物[27]在腦缺血再灌注模型中可發(fā)揮腦血管保護作用，但這種保護作用與腦梗死區(qū)域血管新生的相關性及其分子作用機制鮮有報道，因此本研究對訶子提取物上述保護作用的機制進行了初步探討。由于本課題組前期已初步證實了訶子提取物及其藥效成分的腦保護作用[9-11]，本研究主要針對其促血管新生作用及可能機制進行探索，故未增設陽性對照藥物組。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血EPCs水平顯著下降，神經(jīng)功能學評分顯著下降，且腦組織中可見明顯的梗死區(qū)域，腦梗死體積百分比顯著提高，提示大鼠發(fā)生了腦缺血再灌注損傷，MCAO模型復制成功。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠外周血EPCs水平均顯著升高，且于給藥后3 d達到峰值，同時其神經(jīng)功能學評分顯著提高，腦梗死體積百分比顯著降低，提示訶子提取物對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，并可在用藥早期促進EPCs的大量分化、增殖。隨后本研究又以中、高劑量的訶子提取物為對象，考察了其對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的可能機制。

MVD是反映血管新生能力的有效指標，其值與新生毛細血管豐富度成正比[22]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量的訶子提取物可顯著提高大鼠腦組織梗死區(qū)域的MVD，提示其可改善該區(qū)域血流量，促進神經(jīng)細胞功能的恢復。VEGF在新生血管的生長過程中發(fā)揮著至關重要的作用，研究表明腦缺血再灌注損傷后，VEGF活化可誘導VEGFR表達上調(diào)，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，促進新血管生成，并能在內(nèi)皮細胞內(nèi)誘導抗凋亡蛋白表達，從而維持內(nèi)皮細胞的形態(tài)、保持血管功能的完整性[28-29]。VEGFR2主要在血管內(nèi)皮細胞中表達，是VEGF的特異性膜受體，是一種具有高親和力的酪氨酸激酶受體[30]。來自內(nèi)皮的NO是眾多血管生長因子的下游介質(zhì)，具有增加分泌促血管生成介質(zhì)并促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移的作用，是誘導新血管生成所必需的物質(zhì)[31]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VEGF、VEGFR2、NO水平均顯著升高，提示MCAO模型建立后腦組織相關因子的表達會呈應激性升高；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠上述指標均進一步顯著升高，表明訶子提取物可通過上調(diào)腦組織梗死區(qū)域的VEGF、VEGFR2、NO的表達來促進其微血管新生和神經(jīng)功能恢復。這提示訶子提取物促血管新生的作用可能與上調(diào)VEGF、VEGFR2、NO的表達有關。

綜上所述，本研究初步證實了訶子提取物可提高腦缺血再灌注損傷模型大鼠外周血EPCs水平、神經(jīng)功能學評分和梗死區(qū)域MVD，減小其腦梗死體積，對其缺血再灌注損傷具有一定的保護作用；其機制可能與上調(diào)血管新生相關因子（VEGF、VEGFR2、NO）的表達有關。本研究為藏藥訶子防治腦缺血性疾病提供了實驗依據(jù)。后續(xù)本課題組將進一步探討其具體藥效成分，深入挖掘其作用機制，并開展藥動學、藥效學研究。