文德鑒，丁慧云，斯琴，尹衡，涂星，2，袁麗君，袁林

（1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

三百棒為蕓香科植物飛龍掌血[Toddalia asiatica（Linn）Lam.]的干燥根或根皮，始載于《植物名實(shí)圖考》，又名見血飛、大救駕等，味微苦、辛，性溫，具有祛風(fēng)止痛、散瘀止血、消腫解毒的功效，臨床多用于風(fēng)濕痹痛、胃痛、跌打損傷、吐血、外傷出血、痛經(jīng)、閉經(jīng)、牙齦出血、口舌生瘡等癥的治療[1-2]，為土家族治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的習(xí)用藥物。研究顯示，三百棒主要含生物堿類、香豆素類、黃酮類和三萜類化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗心肌缺血、改善毛細(xì)血管通透性等作用[3-6]。三百棒多產(chǎn)于秦嶺南坡以南各地，最北見于陜西西鄉(xiāng)縣，在長(zhǎng)江流域以湖北恩施、宜昌等地分布較多。由于土家族醫(yī)藥尚未形成體系，多以口耳相傳的形式傳授，導(dǎo)致三百棒名稱眾多、品種混亂，因此，有必要建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

中藥指紋圖譜是一種基于中藥化學(xué)成分信息的綜合的、可量化的鑒別手段，目前已成為國(guó)際公認(rèn)最有效的控制天然藥物及相關(guān)制劑質(zhì)量的方法。中藥指紋圖譜根據(jù)其測(cè)定時(shí)采用的分析手段不同可分為中藥化學(xué)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜，前者又可分為中藥光譜指紋圖譜、中藥色譜指紋圖譜、中藥波譜指紋圖譜以及多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用得到的多維多息指紋圖譜等[7-9]。而高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜屬于中藥色譜指紋圖譜，是一門涉及分析化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的跨學(xué)科技術(shù)，其以中藥的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定為依據(jù)，以重視藥味協(xié)同作用的中藥理論為指導(dǎo)，在確定中藥化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，以中藥各有效成分的整體組成來評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，目前在中藥材及中成藥的質(zhì)量控制及真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別上得到了廣泛的應(yīng)用[10-13]。

本研究旨在通過HPLC指紋圖譜法，對(duì)湖北恩施9個(gè)不同產(chǎn)地的三百棒藥材進(jìn)行質(zhì)量分析，通過指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，綜合比較不同產(chǎn)地藥材之間的差異，為制定全面的三百棒藥材質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C型HPLC儀，含二極管陣列檢測(cè)器、四元梯度高壓輸液系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；VX-200型旋渦混合器（美國(guó)Labnet公司）；Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；TESTO-511型便攜式絕壓表（德國(guó)Testo公司）。

1.2 試劑

巖白菜素對(duì)照品（批號(hào)：111532-201604，純度：94.1%）、毛兩面針?biāo)貙?duì)照品（批號(hào)：111718-201402，純度：＞98%）均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子超純水。

1.3 藥材

三百棒對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121410-200701）；9批三百棒藥材采集于恩施9個(gè)不同產(chǎn)地（見表1），經(jīng)湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院朱敏英副教授鑒定為真品。

表1 三百棒藥材來源Tab 1 Sources of T.asiatica

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.75%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[14]。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取巖白菜素對(duì)照品10 mg、毛兩面針?biāo)貙?duì)照品5 mg，置于同一10 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，得巖白菜素、毛兩面針?biāo)刭|(zhì)量濃度分別為1 000、500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末（過2號(hào)篩）適量，精密稱取0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，50℃下超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：100 kHz）60 min；放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以巖白菜素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以巖白菜素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%（n＝7），相對(duì)峰面積的RSD均小于4%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S2）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以巖白菜素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評(píng)價(jià)、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》對(duì)10批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》，以S1為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批藥材樣品中，有4批相似度均大于0.90，詳見表3。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 10批藥材樣品有14個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)3號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分為巖白菜素，12號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分為毛兩面針?biāo)?。由?號(hào)峰響應(yīng)值更加穩(wěn)定、分離更好，故設(shè)定為參照峰，以此峰計(jì)算其他峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表4、表5。

3 討論

圖1 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of samples

圖2 藥材樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

表3 10批藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 3 Similarity evaluation of 10 batches of samples

筆者通過預(yù)試驗(yàn)比較了分別以乙腈-0.05%磷酸溶液[15]、乙腈-0.1%磷酸溶液[16-17]、乙腈-0.75%冰醋酸溶液[18]作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.75%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)獲得的色譜峰尖銳、基線漂移較小、分離度良好，且色譜峰信息豐富。故選擇乙腈-0.75%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相。筆者還比較了221、230、254、275、300、330、365 nm各檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在275 nm波長(zhǎng)下獲得的色譜峰分離度良好、信息豐富，指紋圖譜的整體特征較穩(wěn)定。故選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表4 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 4 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

表5 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 5 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

通過預(yù)試驗(yàn)，筆者比較了分別以體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、80%、60%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為100%、80%、60%的甲醇作溶劑提取藥材樣品粉末后所獲得的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以80%甲醇作提取溶劑時(shí)獲得的色譜峰數(shù)目較多、峰面積較大；以乙醇提取時(shí)色譜峰數(shù)目雖然較多，但峰面積偏?。欢?dāng)提取溶劑中水的比例過大時(shí)獲得的色譜峰較為雜亂、分離度較低。故選擇80%甲醇作提取溶劑。筆者還以對(duì)照藥材為研究對(duì)象，比較了超聲提取30、60、90 min時(shí)對(duì)色譜圖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取60 min和90 min時(shí)所測(cè)得的巖白菜素和毛兩面針?biāo)氐姆迕娣e無顯著性差異，且均顯著高于提取30 min時(shí)。出于節(jié)能考慮，選擇超聲提取時(shí)間為60 min。

本研究通過對(duì)恩施9個(gè)不同產(chǎn)地的三百棒藥材樣品的HPLC指紋圖譜研究，發(fā)現(xiàn)有14個(gè)共有峰；利川市建南鎮(zhèn)、利川市團(tuán)堡鎮(zhèn)、恩施市鶴峰縣燕子鄉(xiāng)、恩施市巴東縣野三關(guān)鎮(zhèn)所產(chǎn)的藥材樣品與對(duì)照藥材比較相似度均大于0.90，其余產(chǎn)地藥材樣品相似度均小于0.90。結(jié)果表明，利川市建南鎮(zhèn)、利川市團(tuán)堡鎮(zhèn)、恩施市鶴峰縣燕子鄉(xiāng)、恩施市巴東縣野三關(guān)鎮(zhèn)所產(chǎn)三百棒藥材質(zhì)量相對(duì)較佳。而該4個(gè)產(chǎn)地均處于較高海拔地區(qū)，三百棒藥材質(zhì)量是否與其產(chǎn)地的海拔高度有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜可為三百棒藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。