龍凱花，王春柳，李曄#，張紅，劉洋，孫婷婷，宗時宇

（1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安 710125；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003）

穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide）又名穿心蓮乙素，為爵床 科 植 物 穿 心 蓮 [Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees]全草或葉中的主要有效成分之一，具有散熱解毒、消炎止痛的功效，對病毒性痢疾及上呼吸道感染有特殊療效[1-3]，被譽為“天然抗生素”。但穿心蓮內(nèi)酯存在難溶于水、味極苦、口服生物利用度低、易致嘔吐等問題[4]。

自微乳給藥系統(tǒng)（Self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化劑和助乳化劑組成的均勻、澄清的液體系統(tǒng)。該系統(tǒng)在胃腸道內(nèi)可通過胃腸道蠕動自發(fā)形成粒徑小于100 nm的水包油（O/W）型乳劑，可作為生物利用度低、難吸收等藥物的優(yōu)良載體，通過增加藥物的表面積和溶解度，使藥物易于通過胃腸壁水化層傳遞到吸收部位[5-7]。為此，本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯自微乳的制備工藝，旨在為開發(fā)其適用于臨床的新劑型提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311B四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G4212B二極管陣列檢測器、Open LAB色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Agi-lent公司）；BP211D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器、SHA-C型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；ZEN3600型激光粒度儀（英國Marloven公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FOEA26810D型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

穿心蓮內(nèi)酯原料藥（西安天一生物技術(shù)有限公司，批號：TYM140216，純度：98.0%）；穿心蓮內(nèi)酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110797-201108，純度：98.7%）；油酸乙酯（Ethyl oleate，上海飛祥化工廠，批號：20100908）；單亞油酸甘油酯（Maisine 35-1，批號：141597）、油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944 CS，批號：146917）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol，批號：201006）、聚甘油脂肪酸酯（Plurol?Oleique CC 497，批號：127923）、二乙二醇單乙基醚（Transcutol HP，批號：145177）均由法國嘉法獅公司提供；辛酸癸酸三甘油酯（Crodamol GTCC，批號：126715）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH 40，批號：145179）、聚乙二醇硬脂酸酯（Kolliphor?HS 15，批號：29749816K0）均由德國BASF公司提供；油酸（天津津北精細化工有限公司，批號：20100604）；肉豆蔻酸異丙酯（IPM，批號：F20100420）、1，2-丙二醇（批號：T20090119）、聚乙二醇（PEG 400，批號：20100729）均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；聚山梨酯80（大連金州無機化工廠，批號：060307）；泊洛沙姆188（Lutrol?F 68，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，批號：WPEE587E）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 自微乳的制備

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯原料藥、乳化劑及助乳化劑適量，置于錐形瓶中，于37℃水浴中溶解，振蕩混勻；加入油相，于37℃水浴中振蕩混勻，制得穿心蓮內(nèi)酯自微乳。另精密稱取乳化劑及助乳化劑適量，置于錐形瓶中，于37℃水浴中溶解，振蕩混勻；加入油相，于37℃水浴中振蕩混勻，制得空白自微乳。

2.2 處方的篩選

2.2.1 基質(zhì)種類的篩選 通過前期穿心蓮內(nèi)酯的不同乳化劑、助乳化劑及油相的溶解度試驗[8]，初步篩選出基質(zhì)種類配伍組合，并按“2.1”項下方法制備穿心蓮內(nèi)酯自微乳，以外觀、滴入水相中顏色為評價指標，進一步篩選基質(zhì)結(jié)果，結(jié)果見表1。

由表1可知，處方3的基質(zhì)種類配伍較為理想，即油相為油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑為聚氧乙烯氫化蓖麻油，助乳化劑為二乙二醇單乙基醚，此時所得的自微乳外觀澄清、透明，滴入水相中呈現(xiàn)出微泛淡藍色乳光。

2.2.2 基質(zhì)用量范圍的篩選 將乳化劑與助乳化劑按不同質(zhì)量比（1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1）振蕩混勻后，與油相按不同質(zhì)量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）振蕩混勻，滴入水相中。以乳化劑與助乳化劑、油相和水相分別為一條邊，繪制偽三元相圖，通過外觀（是否澄清、透明）和體外乳化試驗（加入水相中是否澄清、透明或是否微泛淡藍色乳光），確定可形成的自微乳區(qū)界限，繪制穿心蓮內(nèi)酯自微乳區(qū)域，詳見圖1（圖中，Km為乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比，A為自微乳區(qū)域）。

表1 不同基質(zhì)種類篩選結(jié)果Tab 1 Type screening of different matrix

圖1 乳化劑與助乳化劑不同質(zhì)量比的偽三元相圖Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of emulsifier and co-emulsifier with different weight ratio

由圖1可知，Km無論取哪個比例，所得的自微乳均澄清、透明，且滴入水相中均呈現(xiàn)出微泛淡藍色乳光，同時穿心蓮內(nèi)酯自微乳區(qū)域可隨Km的增加而增大，故確定Km范圍為1∶2～2∶1。

2.3 響應(yīng)面法的考察指標

2.3.1 粒徑（Y1） 按“2.1”項下方法制備不同處方的穿心蓮內(nèi)酯自微乳，加水稀釋50倍，采用激光粒度儀測定Y1。Y1越小表示穿心蓮內(nèi)酯自微乳越穩(wěn)定。

2.3.2 分散指數(shù)（Y2） 按“2.1”項下方法制備不同處方的穿心蓮內(nèi)酯自微乳，加水稀釋50倍，采用激光粒度儀測定Y2。Y2越小表示穿心蓮內(nèi)酯自微乳分子量分布越均勻。

2.3.3 平衡溶解度（Y3） 將過量穿心蓮內(nèi)酯分別加入按“2.1”項下方法制備的不同處方的空白自微乳中，密封超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，置于37℃水浴中振蕩24 h平衡；4 000 r/min離心15 min，取上清液，加水稀釋10倍，采用HPLC法測定Y3。Y3越大表示穿心蓮內(nèi)酯自微乳載藥量越大。

2.3.4 綜合評分（OD） OD＝（Y1/Y1max）×20%+（Y2/Y2max）×20%+（Y3/Y3max）×60%[9]。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝

2.4.1 試驗設(shè)計與結(jié)果及建模 采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以乳化劑質(zhì)量分數(shù)（A）、助乳化劑質(zhì)量分數(shù)（B）、油相質(zhì)量分數(shù)（C）3個因素為響應(yīng)因子，以Y1、Y2、Y3為考察指標，以O(shè)D為響應(yīng)值，采用3因素3水平設(shè)計試驗，每個水平平行試驗3次求其平均值[10]。因素與水平見表2，試驗方案與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗方案與結(jié)果Tab 3 Trial plan and results

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸和二次多項式擬合回歸。結(jié)果，多元線性回歸模型為OD＝0.67－0.12A+0.065B+0.003 893C+0.027AB－0.024AC+0.032BC（r＝0.656 9），r值較小，表明各變量間線性相關(guān)性較差，模型擬合度不佳、預(yù)測性較差。二次多項式擬合回歸模型為OD＝0.59－0.12A+0.065B+0.003 893C+0.027AB－0.024AC+0.032BC+0.12A2+0.035B2－0.000 145 4C2（r＝0.955 7），r＞0.09，提示模型擬合度較好、預(yù)測性較好。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

由表4可知，所建模型經(jīng)檢驗具有顯著性（P＝0.000 6），說明模型與實際情況吻合良好；模型失擬項檢驗不具有顯著性（P＝0.462 8），說明未知因素對模型擬合結(jié)果干擾小，模型誤差較小。

2.4.2 各因素交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，分別以乳化劑質(zhì)量分數(shù)（A）、助乳化劑質(zhì)量分數(shù)（B）、油相質(zhì)量分數(shù)（C）為響應(yīng)因子，以O(shè)D為響應(yīng)值，繪制響應(yīng)面和等高線圖，詳見圖2。

圖2 各因素對OD影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig 2 Response surface and contour map of the effects of each factor on the comprehensive score

由圖2可知，因素A與B、因素A與C、因素B與C的交互作用均顯著。圖2A、B提示，OD在因素A與B的交互作用下，隨二者的增大而出現(xiàn)先減小后增大的趨勢；圖2C、D提示，OD在因素A與C的交互作用下，隨二者的增大也出現(xiàn)先減小后增大的趨勢；圖2E、F提示，OD在因素B與C的交互作用下，隨二者的增大而增大。

2.4.3 最優(yōu)制備工藝的確定 基于Design-Expert 8.0.6軟件對所建模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得最優(yōu)制備工藝為：聚氧乙烯氫化蓖麻油（乳化劑）、二乙二醇單乙基醚（助乳化劑）、油酸聚乙二醇甘油酯（油相）的質(zhì)量比為40.53∶59.51∶10?？紤]到實際操作的可行性，確定質(zhì)量比為40∶59∶10。

2.4.4 驗證試驗 對上述最優(yōu)制備工藝進行驗證，平行制備穿心蓮內(nèi)酯自微乳3批，對其相關(guān)指標進行測定，結(jié)果見表5、圖3、圖4。由表5、圖3、圖4可知，按上述工藝制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳粒徑、分散指數(shù)、平衡溶解度實測值與預(yù)測值的一致性良好，Zeta電位平均值為－27.15 mV，表明優(yōu)化所得的穿心蓮內(nèi)酯自微乳制備工藝穩(wěn)定、可行。

表5 最優(yōu)制備工藝驗證結(jié)果Tab 5 Verification results of optimal preparation technology

圖3 粒徑分布Fig 3 Distribution of particle size

圖4 Zeta電位分布Fig 4 Distribution of Zeta potential

3 討論

本研究選擇聚氧乙烯氫化蓖麻油為乳化劑，其親水疏水平衡值為14～16，乳化能力強；同時，聚氧乙烯氫化蓖麻油能抑制P糖蛋白的“藥物溢出泵”作用，可提高口服藥物的吸收率[11]。以外觀、滴入水相中顏色為指標，篩選乳化劑、助乳化劑和油相種類；在溶解度試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)所確定的乳化劑、助乳化劑和油相組方繪制偽三元相圖，該圖僅能篩選各基質(zhì)的用量范圍，并不能確定具體的用量值。而采用Box-Behnken響應(yīng)面法可進一步根據(jù)限定的用量范圍，來確定乳化劑、助乳化劑、油相的具體用量。該法能避免人為取點的干擾，與正交設(shè)計法和均勻設(shè)計法相比，該法可選擇多種線性或非線性模型，以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，使優(yōu)化后的工藝更穩(wěn)定[12]。

本研究優(yōu)化后的最佳制備工藝為：乳化劑為聚氧乙烯氫化蓖麻油，助乳化劑為二乙二醇單乙基醚，油相為油酸聚乙二醇甘油酯，三者質(zhì)量比為40∶59∶10。按優(yōu)化工藝制備所得穿心蓮內(nèi)酯自微乳的粒徑為（38.15±1.56）nm，粒徑小、易吸收。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得穿心蓮內(nèi)酯自微乳制備工藝穩(wěn)定、可行，適用于該制劑的制備。