蘇本正，江波，崔寧，于宗淵

（山東省中醫(yī)藥研究院，濟南 250014）

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由白芍、當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、柴胡、薄荷、炙甘草等多味藥材組合而成。明代薛己在此基礎(chǔ)上加入牡丹皮和梔子，制成加味逍遙散，又名丹梔逍遙散，具有養(yǎng)血健脾、疏肝清熱之功效，是調(diào)和肝脾的代表方劑[1]。

有研究表明，白芍中的芍藥苷對模型大鼠腦缺血后的血腦屏障具有保護作用[2]，對腫瘤細胞的生長有一定抑制作用[3]，對肝臟具有保護作用[4]；牡丹皮中的丹皮酚具有抗腫瘤[5]、抗神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷[6]、抗動脈粥樣硬化[7]和改善血液循環(huán)[8]等作用；梔子中的梔子苷具有保肝利膽[9]、改善腦缺血[10]、調(diào)節(jié)血糖[11]和鎮(zhèn)痛抗炎[12]等作用。由此可見，梔子苷、芍藥苷和丹皮酚這3個成分與丹梔逍遙散養(yǎng)血健脾、疏肝清熱的攻效相呼應(yīng)，均為該方重要的活性成分。此外有研究表明，該方中梔子苷、芍藥苷和丹皮酚含量均較高[13]。因此，本試驗選擇梔子苷、芍藥苷和丹皮酚為指標(biāo)成分。

響應(yīng)面法可通過建立連續(xù)變量曲面模型，對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價，最終確定各因素的最優(yōu)水平取值[14]。近年來，響應(yīng)面法逐漸被用于中藥提取條件的優(yōu)化中。美國MathWorks公司發(fā)布的MATLAB遺傳算法與直接搜索工具箱（GADS）是一系列函數(shù)的集合，可讓用戶在響應(yīng)面法結(jié)果的基礎(chǔ)上同時使用遺傳算法[15-16]和直接搜索算法[17]來求解各種優(yōu)化問題。

本試驗以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和液料比為考察因素，以丹梔逍遙散中梔子苷、芍藥苷和丹皮酚3個指標(biāo)成分的綜合評分為評價指標(biāo)，先采用Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面法進行試驗設(shè)計，建立數(shù)學(xué)模型并獲得目標(biāo)函數(shù)后，再結(jié)合遺傳算法和直接搜索算法求解各因素的最優(yōu)范圍與最優(yōu)取值，為該方的提取工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀，包括2996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站等（美國Waters公司）；TDL40B型低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BP211D型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FW-80型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑

1.3 藥材

柴胡（批號：161201）、當(dāng)歸（批號：160501）、白芍（批號：160601）、白術(shù)（批號：160401）、茯苓（批號：161001）、炙甘草（批號：160601）、牡丹皮（批號：160801）、梔子（批號：160701）和薄荷（批號：160901）藥材均購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子苷、芍藥苷、丹皮酚的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm（0～30 min）、232 nm（30～65 min）、274 nm（65～90 min）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。在該色譜條件下，理論板數(shù)以梔子苷、芍藥苷、丹皮酚峰計均大于3 000，分離良好，分離度均大于1.5。色譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取指標(biāo)成分對照品各適量，加甲醇制成梔子苷、芍藥苷和丹皮酚質(zhì)量濃度分別為74.9、56.2、33.4 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取柴胡0.5 g、當(dāng)歸0.5 g、白芍0.5 g、白術(shù)0.5 g、茯苓0.5 g、炙甘草0.4 g、牡丹皮0.75 g、梔子0.75 g和薄荷0.1 g（均粉碎，過4號篩）組成復(fù)方，加入一定量提取溶劑后，稱定質(zhì)量，加熱回流提??；提取液濾過后放冷，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，3 000 r/min離心15 min；取上清液1 mL，用提取溶劑定容至10 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液0、1、2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各指標(biāo)成分進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得梔子苷、芍藥苷、丹皮酚的回歸方程分別為y＝1 483 728x－12 051（r＝0.999 5）、y＝927 308x－20 630（r＝0.997 5）、y＝5 116 603x－44 372（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷、芍藥苷、丹皮酚檢測進樣量線性范圍分別為0.074 9～1.498、0.056 2～1.124、0.033 4～0.668 μg。

2.1.5 方法學(xué)考察 分別進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗，分別測定梔子苷、芍藥苷和丹皮酚的峰面積。結(jié)果梔子苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD均小于3.0%，表明本試驗儀器精密度、方法重復(fù)性均較好，供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 樣品中各指標(biāo)成分的含量測定及綜合評分 取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品中各指標(biāo)成分的含量。以各指標(biāo)成分的最高含量值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化，再按照各指標(biāo)成分的權(quán)重（本研究將梔子苷、芍藥苷和丹皮酚的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為1）計算得綜合評分：綜合評分（Y）＝（梔子苷含量/梔子苷最高含量+芍藥苷含量/芍藥苷最高含量+丹皮酚含量/丹皮酚最高含量）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響 在提取時間2 h、液料比15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的條件下，分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、50%、60%、70%、80%。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標(biāo)成分含量測定并計算綜合評分，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，綜合評分隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而先增加后趨于平緩并略有降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時樣品綜合評分最高，故最終選擇60%乙醇為提取溶劑。

圖2 單因素試驗結(jié)果Fig 2 Results of single factor experiment

2.2.2 液料比對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、提取時間為2 h、提取2次的條件下，分別設(shè)置液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1（V/m，mL/g）。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標(biāo)成分含量測定并計算綜合評分，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，綜合評分隨液料比的增大而先增加后降低最后趨于平緩，當(dāng)液料比為15∶1（mL/g）時綜合評分最高，故最終選擇15∶1（mL/g）為液料比。

摩擦納米發(fā)電機等效電路模型研究……………………………………………………魏子鈞，耿來鑫，邊森 24-5-35

2.2.3 提取時間對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、液料比為15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的條件下，分別設(shè)置提取時間為1.5、2、2.5、3、4 h。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標(biāo)成分含量測定并計算綜合評分，結(jié)果見圖2C。由圖2C可知，綜合評分隨提取時間的延長而先增加后降低，當(dāng)提取時間為3 h時綜合評分最高，故最終選擇3 h為提取時間。

2.2.4 提取次數(shù)對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、提取時間為2 h、液料比為15∶1（V/m，mL/g）的條件下，分別設(shè)置提取次數(shù)為1、2、3、4次。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標(biāo)成分含量測定并計算綜合評分，結(jié)果見圖2D。由圖2D可知，綜合評分隨提取次數(shù)的增多而先增加后趨于平緩，當(dāng)提取2次時綜合評分已高于2.95分，故最終選擇2次為提取次數(shù)。

2.3 BBD響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Design-Expert 8.0.5b軟件，以綜合評分為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）和液料比（C，V/m）為因素，采用BBD響應(yīng)面法進行3因素3水平試驗。因素與水平見表2，BBD響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 BBD響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of BBD respone surface trial

2.3.2 模型擬合和方差分析 運用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗數(shù)據(jù)進行模型擬合，擬合得到的回歸模型為Y＝－15.116 47+0.402 85A+2.266 67B+0.283 86C－0.002 425AB+0.001 12AC－0.016 20BC－0.003 391 75A2－0.300 17B2－0.009 597C2（r＝0.991）。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，該模型的P＜0.000 1，說明模型具有顯著性；失擬誤差的P＝0.065 70.05，說明失擬項不具有顯著性，即該模型對試驗數(shù)據(jù)的擬合情況較好，可較好地分析各因素對丹梔逍遙散指標(biāo)成分提取的影響。方差分析結(jié)果顯示，模型中A、B、C、BC、A2、B2、C2對響應(yīng)值影響顯著，AB、AC影響不顯著。經(jīng)軟件分析可得最優(yōu)提取工藝條件為60.88%乙醇提取3.11 h、液料比15.72∶1（mL/g），在此條件下可得綜合評分為2.895 24。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Analysis results of variance

2.4 遺傳算法求解最優(yōu)提取工藝條件

以“2.3.2”項下擬合模型為目標(biāo)函數(shù)，使用Matlab 2014b軟件的GADS工具箱，采用遺傳算法求解指標(biāo)成分的最優(yōu)提取工藝條件。遺傳算法工具GUI參數(shù)設(shè)置見表5；隨機搜索10次，結(jié)果見表6。由表6可知，10次隨機搜索結(jié)果的變異范圍較小，對目標(biāo)函數(shù)最佳值的逼近程度較好。因此，取10次隨機搜索的平均水平即60.872 000%乙醇提取3.105 564 h、液料比15.719 832∶1（mL/g），預(yù)測綜合評分為2.895 433。

表5 遺傳算法工具GUI參數(shù)設(shè)置Tab 5 GUI parameter setting of genetic algorithm tool

2.5 直接搜索算法求解最優(yōu)提取工藝條件

以“2.3.2”項下擬合模型為目標(biāo)函數(shù)，使用Matlab 2014b軟件的GADS工具箱，采用直接搜索算法求解最優(yōu)提取工藝條件。直接搜索算法工具GUI參數(shù)設(shè)置見表7；隨機搜索10次，結(jié)果見圖3。

表6 遺傳算法搜索結(jié)果Tab 6 Search results of genetic algorithm tool

表7 直接搜索算法工具GUI參數(shù)設(shè)置Tab 7 GUI parameter setting of direct search method tool

由圖3可知，10次隨機搜索結(jié)果完全一致。即以60.871 948%乙醇提取3.105 560 h、液料比15.719 849∶1（mL/g），預(yù)測最優(yōu)綜合評分為2.895 433。

2.6 最優(yōu)提取工藝的確定及工藝驗證

根據(jù)實際情況，確定各因素結(jié)果的小數(shù)位數(shù)，得到BBD響應(yīng)面法的提取工藝優(yōu)化結(jié)果為60.88%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。經(jīng)遺傳算法和直接搜索算法優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝條件與之相差不大，其共同優(yōu)化結(jié)果為60.87%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。分別按照以上兩種優(yōu)化工藝條件進行驗證試驗，每種條件平行操作6次，并就綜合評分進行統(tǒng)計學(xué)配對t檢驗。結(jié)果，兩種工藝條件下的綜合評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－0.851，P＝0.434＞0.05），且樣品綜合評分平均值為2.903，即采用BBD響應(yīng)面法或結(jié)合遺傳算法和直接搜索算法均可較好地對丹梔逍遙散中3個指標(biāo)成分的提取工藝進行優(yōu)化，且結(jié)果無顯著性差異。

圖3 直接搜索算法搜索結(jié)果Fig 3 Search results of direct search method pattern

3 討論

BBD響應(yīng)面法是一種條件尋優(yōu)的試驗設(shè)計方法，可將復(fù)雜的未知函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的模型來擬合，其計算簡便，可減少試驗次數(shù)、降低成本等，具有可連續(xù)對試驗各水平進行分析的優(yōu)勢。遺傳算法借鑒了生物界自然選擇和自然遺傳的機制，使原始數(shù)據(jù)在迭代過程中產(chǎn)生遺傳和變異，并從全局的角度去尋找最優(yōu)試驗條件，可有效避免最優(yōu)試驗條件選取時的主觀性和局部最優(yōu)解問題。直接搜索算法可以作為上述優(yōu)化方法的一個補充，其采用的是模式搜索方法，可搜索出最大、最小正基模式，處理邊界約束、線性等式、線性不等式，并且不需要函數(shù)可微或連續(xù)。但是以上3種方法均存在局限性：BBD響應(yīng)面法要求設(shè)計的試驗點必須包括最優(yōu)試驗條件，因此需要對各因素進行盡量精確的控制；遺傳算法和直接搜索算法均需事先獲得相對準(zhǔn)確的目標(biāo)函數(shù)，進而對目標(biāo)函數(shù)進行最小值精確尋優(yōu)。因此，先采用BBD響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型、獲得目標(biāo)函數(shù)后，再使用遺傳算法或直接搜索算法搜索各因素的精確最優(yōu)值，在優(yōu)化中藥提取工藝方面具有一定優(yōu)越性。本試驗以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和液料比為考察因素，以復(fù)方丹梔逍遙散中3種活性成分的綜合評分為評價指標(biāo)，采用BBD響應(yīng)面法結(jié)合遺傳算法和直接搜索算法求解各因素的最憂取值，可為復(fù)方丹梔逍遙散的提取工藝研究提供一定參考。