一、研究背景

慢性疼痛與抑郁癥共病現(xiàn)象在臨床上很常見，這導(dǎo)致共病的病人更難治療。抑郁癥狀可以導(dǎo)致疼痛時(shí)間延長(zhǎng)和程度加深，從而使疼痛和抑郁癥狀之間產(chǎn)生惡性循環(huán)。找到有效的治療CDS的措施仍然是此領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。以往的研究表明，5-HT能系統(tǒng)功能異常參與抑郁和慢性疼痛。在疼痛調(diào)節(jié)的下行通路中，廣泛認(rèn)為5-HT系統(tǒng)下行調(diào)節(jié)疼痛感覺。疼痛也受到多個(gè)中樞腦區(qū)的調(diào)節(jié)，如丘腦、杏仁體、內(nèi)側(cè)前額葉和島葉等，其中多個(gè)區(qū)域接受5-HT的上行投射。但是，慢性疼痛是否以及如何影響5-HT的上行投射系統(tǒng)并調(diào)節(jié)抑郁的中樞機(jī)制還很不清楚。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些腦區(qū)，如杏仁核和DRN既參與慢性疼痛也參與抑郁癥的調(diào)節(jié)。在神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)上，慢性疼痛和抑郁癥狀之間如何關(guān)聯(lián)還知之甚少。慢性疼痛時(shí)上行5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)功能改變是否導(dǎo)致CDS并不清楚。眾所周知，杏仁復(fù)合體與恐懼學(xué)習(xí)、焦慮以及疼痛等相關(guān)。杏仁體中央核(CeA)被稱為“痛覺杏仁體”，是杏仁體主要的功能輸出部位。深度加工的、多模態(tài)的信息從丘腦、皮質(zhì)和腦干到達(dá)CeA，CeA再與前腦和腦干的腦區(qū)相連，參與恐懼和情緒加工。以往的這些結(jié)果提示CeA可能是慢性疼痛和抑郁的交匯點(diǎn)。然而，CeA環(huán)路的適應(yīng)性改變和CDS的發(fā)病機(jī)理之間的因果關(guān)系尚不清楚?；谛尤鼠w和5-HT系統(tǒng)均參與調(diào)節(jié)疼痛和抑郁癥狀，該文研究了介導(dǎo)CDS的CeA環(huán)路機(jī)制以及慢性疼痛狀態(tài)下5-HT系統(tǒng)在環(huán)路中的作用和對(duì)抑郁樣行為的調(diào)節(jié)。

本研究結(jié)合病毒追蹤、電生理學(xué)、光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)等方法，剖析了DRN→CeA神經(jīng)環(huán)路的功能性組合，探討了這條神經(jīng)環(huán)路在慢性疼痛雄性小鼠中適應(yīng)性改變的原理。此外，本研究還運(yùn)用靜息態(tài)功能性磁共振成像評(píng)估了這種小鼠模型中的神經(jīng)環(huán)路與CDS病人的環(huán)路的相關(guān)性。

二、主要結(jié)果

1.5-HT1ARs介導(dǎo)5-HTDRN→SOMCeA抑制性神經(jīng)通路

杏仁體CeA部位95%神經(jīng)元含有抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA。研究首先用Cre依賴的逆向跨單突觸病毒追蹤方法，顯示谷氨酸脫羧酶2（glutamic acid decarboxylase 2，GAD2，編碼GABA合成酶的基因）-Cre小鼠CeA部位GABA神經(jīng)元上一級(jí)輸入神經(jīng)元。除了已經(jīng)熟知的輸入部位，如杏仁體基底外側(cè)部（BLA）和丘腦室旁核；本研究還發(fā)現(xiàn)DRN核團(tuán)中有DsRed標(biāo)記的神經(jīng)元，說明DRN中神經(jīng)元能支配CeA部位的GABA能神經(jīng)元。這個(gè)結(jié)果非常有意義，因?yàn)橐阎?-HT系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)抑郁癥，常用的抗抑郁藥，如帕羅西汀等，均是作用于這個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁效果。

研究進(jìn)一步明確了CeA部位GABA抑制性神經(jīng)元三種亞型(PV、CR、SOM)的輸入環(huán)路。研究使用了小清蛋白(parvalbumin, PV) -Cre、鈣結(jié)合蛋白(calretinin, CR) -Cre、生長(zhǎng)抑素(somatostatin,SOM) -Cre三種轉(zhuǎn)基因小鼠，將Cre依賴的逆向跨單突觸病毒注射于CeA部位。結(jié)果顯示DRN中DsRed標(biāo)記的神經(jīng)元只出現(xiàn)在SOM-Cre小鼠中，并且通過免疫熒光染色鑒定發(fā)現(xiàn)DsRed標(biāo)記的神經(jīng)元是5-HT能神經(jīng)元。為進(jìn)一步明確這個(gè)結(jié)果，作者用依賴Cre表達(dá)光敏感通道蛋白2 (AAV-DIOChR2-mCherry)注射到Pet1-Cre小鼠（Cre只在5-HT能神經(jīng)元中表達(dá)）的DRN中，4周后切片結(jié)果顯示CeA部位有很多mCherry陽性纖維，并且所有的mCherry陽性神經(jīng)元對(duì)藍(lán)光(473 nm)刺激敏感，95%的mCherry陽性神經(jīng)元是5-HT神經(jīng)元。上述結(jié)果顯示5-HTDRN神經(jīng)元與SOMCeA神經(jīng)元形成單突觸聯(lián)系。

用SOM-Cre和Pet1-Cre小鼠分別與Ai9小鼠雜交，在全細(xì)胞膜片鉗記錄腦片上分別標(biāo)記出SOM-tdTOM和5-HT (Pet1-tdTOM)能神經(jīng)元。來自DRN的神經(jīng)纖維投射到SOMCeA神經(jīng)元的近側(cè)樹突和胞體上。藍(lán)光刺激5-HTDRN神經(jīng)元上ChR2誘導(dǎo)SOMCeA神經(jīng)元產(chǎn)生超極化電流，此電流被5-HT1AR拮抗劑翻轉(zhuǎn)。形態(tài)學(xué)分析也顯示62.3%的5-HT1AR免疫信號(hào)在SOMCeA神經(jīng)元上。

為了確認(rèn)光操控CeA部位5-HTDRN神經(jīng)纖維足以影響SOM陽性神經(jīng)元的活動(dòng)，本研究檢測(cè)了光刺激5-HTDRN末梢后SOMCeA神經(jīng)元的動(dòng)作電位頻率和c-Fos的表達(dá)。光抑制CeA部位5-HTDRN神經(jīng)纖維增加c-Fos表達(dá)，其中74.7%的c-Fos和SOM免疫熒光共標(biāo)。全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示光興奮CeA部位5-HTDRN神經(jīng)纖維降低SOMCeA神經(jīng)元放電頻率，這種作用被5-HT1AR拮抗劑阻斷。相比之下，光刺激CeA部位5-HTDRN神經(jīng)纖維誘導(dǎo)SOM陰性神經(jīng)元去極化，這種作用被5-HT2AR拮抗劑阻斷。免疫熒光顯示79.3%的5-HT2AR表達(dá)于SOM陰性神經(jīng)元。光興奮CeA部位5-HTDRN神經(jīng)纖維增加SOM陽性神經(jīng)元的mIPSCs頻率，5-HT2AR拮抗劑阻斷了這種增加的mIPSCs頻率。上述結(jié)果提示5-HTDRN神經(jīng)纖維投射到SOMCeA神經(jīng)元，導(dǎo)致其超極化；CeA部位SOM陰性神經(jīng)元抑制局部的SOM陽性神經(jīng)元。

2.慢性疼痛小鼠腦內(nèi)5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)通路發(fā)生去抑制

為了研究5-HTDRN-SOMCeA環(huán)路在CDS中的作用，本研究采用了保留性坐骨神經(jīng)損傷(Spared nerve injury, SNI)誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛和完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant, CFA)誘導(dǎo)的炎癥性疼痛模型。SNI后6周和CFA注射后3周，小鼠產(chǎn)生了明顯的抑郁樣行為。在Pet1-tdTOM小鼠CeA部位注射CTB-488標(biāo)記投向CeA部位的DRN中5-HT神經(jīng)元，電生理記錄這些神經(jīng)元顯示SNI后6周時(shí)放電數(shù)目減少。在體微透析也檢測(cè)到CeA部位的5-HT濃度在SNI后6周時(shí)減少。

如果SOMCeA神經(jīng)元被5-HTDRN神經(jīng)元輸入抑制，那么在慢性疼痛時(shí)這種輸入減弱將去抑制SOMCeA神經(jīng)元。研究觀察到SNI后6周時(shí)SOM陽性神經(jīng)元的發(fā)放頻率增加了，但靜息膜電位沒變化。用化學(xué)遺傳抑制SNI后6周時(shí)SOM陽性神經(jīng)元的活動(dòng)減輕了抑郁樣行為。

3.5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路在慢性疼痛伴抑郁樣行為中發(fā)揮充分必要作用

考慮到慢性疼痛時(shí)5-HTDRN→CeA的輸入減少，本研究用化學(xué)遺傳方法興奮5-HTDRN神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)SNI誘導(dǎo)的抑郁樣行為得到緩解，這種作用被局部CeA注射5-HT1AR拮抗劑阻斷。光遺傳激活CeA部位的5-HTDRN神經(jīng)末梢產(chǎn)生了相似的作用，同時(shí)還恢復(fù)了SNI誘導(dǎo)的痛閾值的降低。在正常小鼠中，光抑制CeA部位的5-HTDRN神經(jīng)末梢產(chǎn)生了抑郁樣行為。CeA局部注射5-HT1AR激動(dòng)劑明顯緩解了SNI誘導(dǎo)的抑郁樣行為。但是CeA局部注射選擇性5-HT重?cái)z取抑制劑(SSRIs)則沒有這種效果。慢性束縛應(yīng)激(CRS)和慢性社會(huì)斗爭(zhēng)失敗應(yīng)激(SDS)兩種抑郁模型中CeA部位5-HT含量不變。光激活5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路也不影響CRS和SDS誘導(dǎo)的抑郁樣行為。這些結(jié)果提示5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路參與調(diào)解慢性疼痛誘導(dǎo)的抑郁樣行為，而非其它應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥。

4.外側(cè)韁核作為5-HTDRN→SOMCeA環(huán)路的輸出部位調(diào)控小鼠慢性疼痛伴抑郁樣行為

AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒注射到SOMCre小鼠CeA部位，在外側(cè)韁核（LHb，參與抑郁的核團(tuán)）觀察到大量的mCherry陽性纖維。出乎意料的是，光興奮LHb中SOMCeA神經(jīng)末梢能誘導(dǎo)出近一半(12/25)的LHb神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性突觸后電流(EPSCs)和抑制性突觸后電流(IPSCs)。但是也有近一半(11/25)的LHb神經(jīng)元只有EPSCs，只有極少數(shù)(2/25)的LHb神經(jīng)元只有IPSCs。在GAD2-Cre和CaMKII-Cre小鼠的LHb注射逆向跨單突觸病毒，結(jié)果顯示CeA部位中DsRed標(biāo)記的神經(jīng)元只在CaMKII-Cre小鼠中觀察到，在GAD2-Cre小鼠中并未觀察到。CeA部位中DsRed標(biāo)記的神經(jīng)元與SOM和VGLUT2共標(biāo)，而且絕大多數(shù)(82.9%)DsRed神經(jīng)元有5-HT1AR，很少(9.6%)有5-HT2AR。順行跨單突觸病毒結(jié)合免疫熒光也證明了SOMCeA在LHb下一級(jí)神經(jīng)元是VGLUT2陽性。電生理記錄顯示SNI后6周時(shí)LHb中CaMKII陽性神經(jīng)元放電增加。光遺傳激活LHb中SOMCeA神經(jīng)末梢使正常小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，相反光抑制SOMCeA神經(jīng)末梢使SNI后6周小鼠抑郁樣行為減輕。

為了證明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環(huán)路的聯(lián)系，研究者在LHb注射逆向AAV (AAV2/2Retro-CMV-bGl-Cre-EGFP)使得SOMCeA神經(jīng)元表達(dá)Cre-GFP，再在CeA部位注射Cre依賴的逆向跨單突觸病毒。結(jié)果顯示DRN中出現(xiàn)了很多DsRed陽性神經(jīng)元，并且是5-HT陽性。為了證明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環(huán)路的功能，研究者用SOM-tdTOM小鼠在LHb注射CTB-488來標(biāo)記投射到LHb的SOMCeA神經(jīng)元，DRN注射AAV-hSyn-ChR2-mCherry。腦片電生理記錄發(fā)現(xiàn)光興奮CeA中5-HTDRN纖維誘導(dǎo)CTB-488標(biāo)記的SOM陽性神經(jīng)元超極化，這種作用被5-HT1AR阻斷。這些CTB-488標(biāo)記的SOMCeA神經(jīng)元在SNI后6周興奮性增加，且不受5-HT2AR拮抗劑的影響。這些結(jié)果說明5-HTDRN→SOMCeA→GluLHb環(huán)路可能參與調(diào)解CDS病人的抑郁樣行為。

5.CDS病人DRN和CeA的功能連接減弱

研究進(jìn)一步運(yùn)用靜息態(tài)fMRI評(píng)估了該環(huán)路在疼痛抑郁共病的病人是否也發(fā)揮作用。與沒有慢性疼痛的抑郁癥病人相比，CDS病人的杏仁體中央內(nèi)側(cè)核(CM)與多個(gè)腦區(qū)（包括DRN）間的功能連接降低。尤其是DRN-CM通路的功能連接降低只出現(xiàn)在慢性疼痛共病抑郁病人。在無慢性疼痛的抑郁癥病人和慢性疼痛無抑郁癥的病人不存在這種降低。而且在慢性疼痛共病抑郁病人，這個(gè)通路的功能連接與抑郁量表呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示慢性疼痛病人的DRN-CM連接和抑郁癥狀有關(guān)聯(lián)。

三、討論

選擇性5-羥色胺再攝取抑制藥(SSRIs)對(duì)慢性疼痛共患抑郁癥狀(CDS)病人的治療效果遠(yuǎn)不能令人滿意，這表明CDS中涉及一種獨(dú)特的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。與這一現(xiàn)象相一致，本研究證明在杏仁體的中央核(CeA)注射帕羅西汀對(duì)慢性疼痛小鼠的抑郁樣行為沒有明顯影響。相比之下，激活CeA中5-HT1ARs能減少這些小鼠的抑郁樣行為，表明5-HT1ARs 介導(dǎo)的5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路可能在慢性疼痛引起的抑郁樣行為中發(fā)揮作用。SSRIs通過至少14種5-羥色胺(5-HT)受體亞型調(diào)節(jié)整個(gè)大腦的5-HT能系統(tǒng)，因此，SSRIs對(duì)多種5-HT受體亞型的整體作用，可能導(dǎo)致無法有效治療CDS病人。事實(shí)上，SSRI抗抑郁藥的確切靶點(diǎn)仍然難以確定。因此，單一的5-HT受體亞型，如5-HT1ARs，可能作為開發(fā)治療CDS病人的抗抑郁藥的新靶點(diǎn)。

研究疾病的神經(jīng)環(huán)路的優(yōu)點(diǎn)是能夠揭示影響藥物作用和病理性行為后果的共同位點(diǎn)。本研究提出了一種導(dǎo)致CDS的神經(jīng)環(huán)路的假設(shè)，即慢性疼痛通過SOMCeA神經(jīng)元上的5-HT1ARs導(dǎo)致5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路的去抑制，并且由此產(chǎn)生的LHb神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)導(dǎo)致抑郁癥狀。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CDS以一種狀態(tài)依賴性方式出現(xiàn)，伴隨著CeA中5-HT的降低和SOMCeA神經(jīng)元活性逐漸增加。疼痛的持續(xù)時(shí)間對(duì)于動(dòng)物的抑郁很重要，因?yàn)樾∈笤赟NI手術(shù)后6周才表現(xiàn)出抑郁樣行為。這種行為結(jié)果可能歸因于進(jìn)行性疼痛期間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)。5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路在SNI慢性疼痛模型6周小鼠中的適應(yīng)變化改變了LHb的活動(dòng)，從而促進(jìn)了抑郁樣行為的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)激活5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路減輕了慢性疼痛小鼠的抑郁樣行為，但對(duì)慢性應(yīng)激小鼠引起的抑郁行為沒有影響，表明這種神經(jīng)環(huán)路可能只在慢性疼痛時(shí)參與。這一點(diǎn)與臨床的fMRI的數(shù)據(jù)一致?；趤碜詣?dòng)物和臨床的數(shù)據(jù)，本研究提供了關(guān)于該神經(jīng)環(huán)路的行為功能的跨物種轉(zhuǎn)化研究。

包括DRN在內(nèi)的腦干是將傷害性信息傳送到腦更高中樞的關(guān)鍵腦區(qū)。然而，上行的5-HTDRN神經(jīng)系統(tǒng)是否調(diào)控CDS仍然不清楚。CeA神經(jīng)微環(huán)路的系列結(jié)構(gòu)提示，SOM陽性神經(jīng)元的活動(dòng)穩(wěn)態(tài)至少部分由5-HTDRN輸入精細(xì)控制。5-HTDRN投射主要通過突觸后5-HT1ARs介導(dǎo)超極化過程抑制CeA中SOM陽性神經(jīng)元，而通過突觸后5-HT2ARs興奮SOM陰性神經(jīng)元。所以在持續(xù)疼痛狀態(tài)下，SOMCeA神經(jīng)元的高活動(dòng)性由雙重去抑制驅(qū)動(dòng)；即通過直接削弱突觸前5-HTDRN輸入和減弱局部SOM陰性神經(jīng)元功能。此外，5-HTDRN適應(yīng)不良促進(jìn)谷氨酸能突觸傳遞的機(jī)制可能涉及平行途徑，例如，從外側(cè)杏仁體到CeA部位SOM陽性神經(jīng)元。由于SOM陽性神經(jīng)元活動(dòng)受突觸前5-HT的調(diào)節(jié)，5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路的不良適應(yīng)可能在慢性疼痛狀態(tài)下持續(xù)存在。這種復(fù)雜的情況可能是CDS病人抗抑郁治療效果不好的原因。

LHb接收來自許多參與應(yīng)激反應(yīng)的大腦區(qū)域的投射，這些投射可能介導(dǎo)抑郁的不同癥狀。以往的研究表明，在抑郁癥動(dòng)物模型中，LHb谷氨酸能神經(jīng)元的突觸傳遞增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，SOMCeA神經(jīng)元主要通過谷氨酸能投射支配GluLHb神經(jīng)元。因此，患有慢性疼痛和抑郁樣癥狀的小鼠中，可能通過增加的SOMCeA谷氨酸能輸入激活GluLHb神經(jīng)元活動(dòng)。該假設(shè)支持韁核神經(jīng)元的突觸效能增強(qiáng)促進(jìn)嚙齒動(dòng)物的抑郁樣行為的觀點(diǎn)。因此，我們提出盡管LHb是抑郁病理生理學(xué)的共同區(qū)域，但5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路的細(xì)胞類型特異性調(diào)節(jié)的改變可能是治療耐藥性抑郁癥發(fā)展的普遍機(jī)制，包括CDS。此外，盡管5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路可能有助于多種行為產(chǎn)生，如恐懼、焦慮和抑郁，但該環(huán)路對(duì)LHb的特定投射可能參與慢性疼痛誘導(dǎo)的抑郁樣行為。這些發(fā)現(xiàn)說明抑郁癥的不同病因，例如慢性疼痛和壓力應(yīng)激，可能由不同的神經(jīng)環(huán)路編碼。

本研究發(fā)現(xiàn)激活5-HTDRN→SOMCeA神經(jīng)環(huán)路緩解了疼痛癥狀。這種效應(yīng)可能涉及杏仁體介導(dǎo)的下行疼痛控制系統(tǒng)。由于治療CDS的藥理學(xué)選擇仍然有限，這些發(fā)現(xiàn)提示使用非藥物療法如深部腦刺激或經(jīng)顱磁刺激靶向整合性神經(jīng)通路治療CDS的可能性，從而更好的治療這類疾病。