摘要：目的：觀察重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）對四氯化碳（CCL4）肝硬化大鼠外周血中CD34+細胞的動員作用，以及對肝硬化大鼠肝臟生化學的影響，尋求一種安全有效、不加重肝損傷的動員CD34+細胞的方法。方法：50%CCL4橄欖油溶液建立肝硬化大鼠模型，rhG-CSF動員組大鼠皮下注射rhG-CSF10gkg-1d-1，共計5d，對照組給予相同劑量生理鹽水。流式細胞儀測定外周血單個核細胞中的CD34+細胞的比例，同時檢測ALT、AST、T-BIL和ALB，觀察G-CSF對肝硬化大鼠肝臟的影響。結果：肝硬化大鼠rhG-CSF動員后外周血CD34+細胞占單個核細胞（CD34+/MNC）比例（4.081.38）%是生理鹽水對照組（0.430.21）%的9.5倍；而生化學檢測兩組沒有顯著性差異。結論：G-CSF動員能促進更多的骨髓/造血干細胞源性的肝干細胞在外周血中表達，而且不加重肝硬化大鼠的肝臟損傷。

關鍵詞：粒細胞集落刺激因子（G-CSF）；干細胞；CD34細胞動員

肝炎病毒、酒精、藥物、化學物質(zhì)以及遺傳代謝等等諸多原因皆可以損傷肝臟功能，最終表現(xiàn)為肝硬化、肝功能衰竭等終末期肝臟病變，嚴重危害人們的身體健康。終末期肝病一般需要肝移植才能徹底解決，但是由于肝臟供體來源受限，人們逐漸嘗試肝干細胞替代治療的方法來讓病人度過手術等待期，或用這種方法進行肝臟病人的治療。

目前認為肝臟干細胞主要有肝源性和非肝源性兩個方面的來源。肝源性肝干細胞主要為肝卵圓細胞（hepaticovalcell，HOC）。HOC是從小鼠肝臟中分離出來的，當各種致病因素使肝細胞增殖受限時，HOC可進一步分化為肝細胞及膽管上皮細胞，因而認為是一種肝干細胞?，F(xiàn)在已經(jīng)有證據(jù)表明至少有一部分HOC是由骨髓源前體細胞演變而來。Crosby采用骨髓造血干細胞標志c-Kit和CD34觀察肝硬化患者肝組織存在著CD34+細胞，其主要位于膽管周圍的門靜脈區(qū)。因此，HOC是一類具有骨髓干細胞的某些表型、克隆原性及雙向分化潛能的細胞。

骨髓/造血干細胞可以由骨髓、臍帶血和外周血三種來源獲得。外周血造血干細胞有著收集方便、來源廣泛、供體不需要麻醉、創(chuàng)傷小以及易于患者接受等優(yōu)勢，因而受到了越來越多的重視。

本研究是通過粒細胞集落刺激因子（granularcellstimu latingfactor，G-CSF）對四氯化碳（CCL4）致肝硬化大鼠進行動員，檢測肝臟以及外周血中CD34+細胞表達的變化，觀察G-CSF對外周血干細胞的動員作用，同時觀察動員的肝硬化大鼠肝臟的生化學、組織病理學改變，評價G-CSF對肝硬化大鼠機體的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體重180～220g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫22～26，飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2主要試劑及藥品

重組人粒細胞集落刺激因子、兔抗鼠CD34抗體、FITC-羊抗兔IgG抗體、RPMI1640、胎牛血清和Ficoll分離液分別由日本麒麟株式會社、Santa-Cruz公司、Jackson公司、Gibco公司和Sigma公司生產(chǎn)。

1.3實驗分組

將36只大鼠隨機分為四組，正常組6只，不進行任何處理。余30只進行CCL4造模，造模成功后處死6只作為肝硬化模型組。對造模成功的大鼠隨機分為生理鹽水組和G-CSF動員組各8只。

1.4實驗方法

1.4.1肝硬化模型的制備

經(jīng)大鼠大腿內(nèi)側、背部、腹部皮下注射50%的橄欖油CCL4溶液（橄欖油與CCL4的體積比為1?1），劑量3mL/kg，1次/3d，測量大鼠體重，根據(jù)體重調(diào)整劑量，注射23次后停藥觀察大鼠體重，以不增加為準，若仍體重增加，原量注射直至體重恒定。肝臟組織病理學證實模型成功。

1.4.2肝臟組織病理學檢查。對肝硬化模型建立的組織病理，使用石蠟切片。取造模大鼠肝臟右葉，切成1cm#1cm#0.5cm大小組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，5m切片，行HE染色和Masson染色。常規(guī)病理制片，顯微鏡下由同一名病理醫(yī)生閱片，找尋10步驟的拍攝區(qū)域普通顯微鏡拍照。

1.4.3G-CSF動員

動員組8只大鼠每天早晨9點鐘，皮下注射G-CSF10gkg- 1d-1，連續(xù)5d，對照組8只注射同劑量生理鹽水。

1.4.4肝功能生化學檢查

血清采集后-20！保存，一次上機檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（T-BIL）和白蛋白（ALB），由同一全自動生化分析儀完成。

1.4.5動員后外周血CD34+細胞表達的評價

MNC的提取%流式細胞儀檢測MNC中CD34+細胞

1.4.6統(tǒng)計學分析。使用SPSS10.0軟件對正常大鼠、肝硬化大鼠、G-CSF動員后大鼠的ALT、AST、TBIL、ALB以及流式細胞儀檢測的CD34+細胞占MNC的百分比進行統(tǒng)計分析，計量資料采用xs（均數(shù)標準差）表示，方差齊時t檢驗，方差不齊t檢驗。等級資料采用卡方檢驗。

2結果

2.1肝硬化動物模型的建立

30只大鼠使用50%CCL4造模過程中，死亡4只，死亡率13.3%。經(jīng)HE、Masson染色進行肝臟組織病理學檢查，可見膠原纖維大量增生、包繞變性壞死肝細胞及大小不等的假小葉形成等，組織學證實肝硬化造模成功。50%CCL4皮下注射26次后，大鼠ALT，AST，TBIL都有不同程度的升高（P<0.01），白蛋白下降（P<0.01）。提示造模大鼠有明顯的肝功能損害。

2.2G-CSF動員效果對比

使用流式細胞儀對周血中CD34+細胞進行檢測。結果顯示，動員組肝硬化大鼠外周血中CD34+細胞占MNC比例為（4.081.38）%，是生理鹽水組（0.43+-0.21）%的9.5倍，P<0.01。

2.3使用rhG-CSF動員與生理鹽水對照組生化指標對比

兩組肝功能生化指標（ALT、AST、ALB、TBIL）變化對比，無顯著性差異，P>0.05。

3討論

G-CSF是由Welte等在1985年克隆并純化的，由2個長環(huán)和1個短環(huán)連接的4條反向平行的螺旋鏈組成。自90年代初獲準臨床應用。目前認為G-CSF動員的機制主要有以下幾個方面：?影響造血干細胞表面黏附分子的表達及功能，特異性誘導粒系祖細胞的增殖、分化和成熟，并抑制外周血造血干細胞的凋亡。下調(diào)骨髓微環(huán)境內(nèi)皮細胞粘附分子的表達，促進基質(zhì)金屬蛋白酶釋放及降解細胞外基質(zhì)。G-CSF對CD34+細胞的動員作用是呈動態(tài)變化的。研究發(fā)現(xiàn)，對健康者皮下注射G-CSF，外周血CD34+細胞數(shù)量在第6天達到高峰，其數(shù)量與G-CSF用量相關。本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，肝硬化大鼠G-CSF連續(xù)使用5d后，外周血中CD34+細胞占單個核細胞的比例較使用生理鹽水增加了9.5倍。G-CSF對肝硬化大鼠外周血中的CD34+細胞有很明顯的動員作用，且沒有加重肝臟損傷的影響。目前，對肝硬化個體的動員以獲得CD34+細胞的研究還未見報道。

綜上所述，G-CSF對肝硬化大鼠是一種安全有效的獲取外周血中更多CD34+細胞的方法。動員后的外周血中骨髓/造血干細胞源性的肝干細胞，可以用于多種部位的自體移植或者在體外培養(yǎng)擴增分化為肝細胞的研究，從而為各種終末期肝病的細胞學治療提供一種可能的細胞來源。

參考文獻：

[1]立野知世，吉田勝利.肝膽細胞.蛋白核酸酵素.[J] 2000，45：2085-2091