王 弦 李曉燦 江冬瑞 葉飛飛 吳 強(qiáng)

近年來，隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及對肺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制方面的深入研究，以分子靶向診療為核心的“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念被人們所提出并應(yīng)用到臨床中，給肺癌的治療帶來了新的契機(jī)[1]?？诉蛱婺崾轻槍ML4-間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)新的治療靶點(diǎn)，全球每年新發(fā)肺癌ALK突變陽性患者約有6.8萬人，這些患者均可從靶向治療藥物克唑替尼中獲益[2-3]。因此，開展針對EML4-ALK融合基因的檢測具有重要的臨床意義?；诖?，為研究肺癌患者EML4-ALK融合基因的陽性率，提高肺癌診治水平，本研究選取100例NSCLC患者為研究對象，采用CSCO腫瘤生物標(biāo)志物專家委員會專家組所推薦的全自動免疫組化的方法檢測ALK的表達(dá)，并與患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計分析，以期為相關(guān)疾病的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 抗ALK兔單克隆抗體(D5F3)、陰性質(zhì)控抗體、OptiView DAB免疫組化檢測系統(tǒng)和增強(qiáng)試劑盒[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；Ventana Bench Mark XT全自動免疫組化儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；正電荷黏附載玻片(江蘇世泰實(shí)驗器材有限公司)。

1.2 研究對象 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年1月至2017年10月收治的經(jīng)病理診斷確診為非小細(xì)胞肺癌的100例患者作為研究對象，所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)均依照WHO(2015年)肺腫瘤分類。患者年齡42～82歲，平均 (62.50±8.00)歲；男性59例，女性41例；48例有吸煙史，52例無吸煙史；腫瘤直徑≤5 cm的77例，腫瘤>5 cm的23例；左肺腫瘤42例，右肺腫瘤58例；腺癌84例，非腺癌16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。采集基本臨床特征資料：年齡、性別、吸煙史、腫塊直徑、發(fā)生部位、病理分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。所有數(shù)據(jù)采集均征得患者同意并簽署知情同意書。

1.3 方法 所有標(biāo)本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，制作石蠟標(biāo)本后進(jìn)行組織切片，切片厚度為4 μm，分成陰性質(zhì)控片組和檢測片組。其中，在檢測片組撈取1個正常闌尾切片作為陽性對照組。按照羅氏公司ALK蛋白檢測說明流程上機(jī)檢測。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn) 采用二元判讀法，根據(jù)是否存在二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)信號，每位患者均同時判讀ALK抗體檢測片和相應(yīng)的陰性質(zhì)控片。陰性質(zhì)控片評估非特異的背景染色和已知會因特定組織成分而染色的背景染色強(qiáng)度；ALK(D5F3)抗體檢測片上正常闌尾的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞DAB顯色作為陽性對照，幫助判斷此張切片染色是否成功；待檢組織腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為：陽性為腫瘤細(xì)胞中存在很強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色(任何百分比的陽性腫瘤細(xì)胞)；陰性為腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀胞漿染色。其中，診斷為陽性時需排除已知的染色元素，包括：肺泡巨噬細(xì)胞中較淡的胞漿點(diǎn)彩；神經(jīng)來源的細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)；腺狀上皮染色，以及淋巴細(xì)胞性浸潤中的細(xì)胞。另外，NSCLC患者正常黏膜(包括黏蛋白)內(nèi)以及壞死組織區(qū)域內(nèi)可見一些背景染色也應(yīng)從臨床評估中排除。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALK在NSCLC患者中的表達(dá) ALK陽性可見很強(qiáng)的顆粒狀棕黃色胞漿染色，主要表達(dá)定位于肺癌組織的細(xì)胞質(zhì)；ALK陰性未見任何顆粒性棕黃色陽性信號；陽性對照組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈陽性，見圖1。100例NSCLC患者中，有6例ALK陽性，陽性表達(dá)率為6.00%。

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者ALK表達(dá)比較 不同年齡區(qū)間患者的ALK陽性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同腫塊直徑間患者的ALK陽性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同病理分型間患者的ALK陽性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而不同性別、是否吸煙、發(fā)生部位以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間患者的ALK陽性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界危害人類健康最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率近年呈逐年升高的態(tài)勢，其病死率已躍居首位，且5年生存率較低[4-5]。我國是肺癌的高發(fā)國家之一，發(fā)病率及病死率都高于世界平均水平。NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌和類癌等。傳統(tǒng)的一線化療藥物鉑類在肺癌的治療中一直處于主導(dǎo)地位，但由于傳統(tǒng)的化療藥物缺乏組織特異性，且長期用藥對患者身體帶來非常大的副作用，是肺癌治療方面多年來所面臨的難題之一[6-7]。

ALK是一種由人類ALK基因編碼的酶，又被稱為酪氨酸激酶受體或CD246，是胰島素受體超家族成員之一[8]。ALK在大腦的發(fā)育過程中扮演著重要的角色，由于其編碼的酪氨酸激酶只在一定的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，因此只對神經(jīng)系統(tǒng)中的特定神經(jīng)元產(chǎn)生影響。作為一種新的受體酪氨酸激酶，ALK基因在細(xì)胞生理活動中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其異常表達(dá)時常通過擴(kuò)增、突變和形成融合基因等方式產(chǎn)生強(qiáng)致癌驅(qū)動基因，從而導(dǎo)致肺癌、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤的產(chǎn)生[9]。1994年，Morris等[8]發(fā)現(xiàn)ALK以NPM-ALK融合蛋白的形式存在于間變性大細(xì)胞淋巴瘤；2007年，Soda等[10]發(fā)現(xiàn)EML4與ALK基因在約6.7%的NSCLC患者中發(fā)生融合突變。EML4-ALK融合基因由第2號染色體插入形成，其編碼的蛋白產(chǎn)物可導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶持續(xù)高表達(dá)，從而激活下游的PI3K-AKT、MAPK及JAK-STAT等信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，在NSCLC中發(fā)揮重要的驅(qū)動作用，被認(rèn)為是NSCLC新興的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，對肺癌的臨床診療具有十分重要的生物學(xué)意義。

克唑替尼作為ALK融合基因的小分子靶向藥物，在臨床治療中顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。因此，準(zhǔn)確地檢測ALK并研究總結(jié)其臨床病理特征顯得尤為重要。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，4981例NSCLC患者中有405例ALK表達(dá)陽性，其預(yù)后明顯好于ALK陰性患者，且患者的吸煙狀況也影響ALK基因相關(guān)的NSCLC患者的預(yù)后。Inamura等[12]發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因主要存在于輕度吸煙者(每年少于10包)或不吸煙的的腺癌患者中，并且與表皮生長因子受體或鼠類肉瘤病毒癌基因突變無關(guān)。Dai等[13]研究表明對ALK陽性的NSCLC患者使用ALK抑制劑可能會增加放療的局部控制效果，針對晚期的NSCLC患者在放療之前進(jìn)行ALK檢測，繼而通過聯(lián)合ALK抑制劑和放療，從而為臨床提供一種毒性較低的治療方案。

本研究采用全自動免疫組化法檢測了100例NSCLC患者的ALK蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ALK主要表達(dá)定位于肺癌的細(xì)胞質(zhì)中，且NSCLC患者的ALK陽性表達(dá)率為6.00%，與黃曉琳等[14]研究(3%～8%)數(shù)據(jù)一致。分析發(fā)現(xiàn)，ALK陽性患者41～60歲人群的占比較高；女性和不吸煙者占優(yōu)勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ALK陽性患者組織學(xué)類型以腺癌為主，且腫瘤直徑以≤5 cm居多，但腫瘤的發(fā)病部位沒有顯著特征；另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于ALK陰性患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)國內(nèi)相關(guān)研究[14-16]，ALK陽性患者以年輕、女性、不吸煙及腺癌為主要特征，本研究顯示出同樣的結(jié)果。然而本研究將不同性別、吸煙史、發(fā)生部位以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間患者ALK陽性表達(dá)率進(jìn)行相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能由于本研究的病例數(shù)較少，從而導(dǎo)致陽性樣本偏少引起的偏差。另外，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑可能成為ALK陽性患者的潛在特征，下一步研究中將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)，有望為NSCLC的臨床診療提供新的理論依據(jù)和參考。