朱金鋒 綜述，王小林審校

南通市腫瘤醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南通 2263610

膀胱癌占中國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第1位，據(jù)2015年中國癌癥年報統(tǒng)計，2015年中國約有8.05萬新發(fā)病例，約3.29萬患者死于膀胱癌[1]。膀胱尿路上皮細胞癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）是最常見的組織學(xué)類型，占膀胱癌的90%以上[2]。研究顯示，近75%的新診斷的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[2]，根據(jù)臨床治療指南，該類膀胱癌通常采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)伴或不伴膀胱內(nèi)的灌注治療[3]；其余25%的膀胱癌為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），其標(biāo)準治療方法為根治性膀胱切除術(shù)和雙側(cè)淋巴結(jié)清掃術(shù)伴或不伴圍手術(shù)期化療[4]。研究表明，50%的NMIBC患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)，多達30%的患者盡管接受了有效的治療，但最終還是進展為MIBC，導(dǎo)致預(yù)后較差[5]。因此，膀胱癌患者需終生嚴密隨訪。

膀胱鏡檢查及尿液脫落細胞學(xué)檢查仍是膀胱癌診斷的金標(biāo)準。膀胱鏡檢查膀胱癌的靈敏度為90%，但它是一種侵入性檢查，且費用昂貴，患者對隨訪的依從性較差[6]。尿液脫落細胞學(xué)檢查是一種特異度高（99%）的檢測方法，但靈敏度較低（34%），特別是診斷低級別腫瘤時靈敏度更低[7-8]，而且受到檢查者主觀因素的影響。因此，為了提高膀胱癌患者的生活質(zhì)量和管理水平，許多研究者都在尋找一種非侵入性、高靈敏度和特異度的膀胱腫瘤標(biāo)志物。尿液是與膀胱癌直接接觸的體液，而且可以被大量地非侵入性地收集，尿液標(biāo)志物檢測膀胱腫瘤是未來的發(fā)展趨勢。迄今為止，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已經(jīng)批準將BTA-stat、BTAtrak、NMP22 BladderChek Test、NMP22BC test kit、ImmunoCyt、UroVysion、CxBladder、FDP 等用于臨床。這些檢測方法與尿液脫落細胞學(xué)檢查相比，雖然具有較高的靈敏度，但因特異度較差而未能在臨床上普及。因此，迫切需要一種特異性標(biāo)志物用于膀胱癌的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測。

1 美國FDA已經(jīng)批準用于臨床的尿液膀胱腫瘤標(biāo)志物

1.1 核基質(zhì)蛋白22

核基質(zhì)蛋白（nuclear matrix protein，NMP）是一種蛋白質(zhì)家族，在細胞核的結(jié)構(gòu)框架中發(fā)揮重要作用，并與DNA復(fù)制、RNA合成及激素合成有關(guān)。核基質(zhì)蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）是構(gòu)成細胞核內(nèi)部框架的裝配蛋白，使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)在有絲分裂期間有規(guī)律地分布到子細胞中[9]。有研究表明，膀胱癌患者尿液中的NMP22濃度是健康者的5倍[10]。目前，研究者已經(jīng)研究出了2種檢測尿液中NMP22水平的方法，一種是定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），另 一 種 是 定 性 的NMP22 BladderChek試驗，后者被應(yīng)用于床旁檢測（point of care，POC）。在NMP22的檢測試劑盒上滴幾滴尿液，30 min內(nèi)便可獲得結(jié)果。這兩項測試均已獲美國FDA批準用于膀胱癌的監(jiān)測。一項納入41項研究、涉及13 885例患者的Meta分析結(jié)果顯示，NMP22檢測膀胱癌的靈敏度為68%，高于尿液脫落細胞學(xué)檢查的44%，但NMP22檢測的特異度低于尿液脫落細胞學(xué)檢查（79%vs95%）[11]。由于NMP22是一種普遍存在的核蛋白，因此炎性感染、血尿、尿石癥或手術(shù)創(chuàng)傷都會增加尿中NMP22的釋放[12-13]。研究表明，NMP22結(jié)合膀胱鏡檢查可使膀胱癌的復(fù)發(fā)檢出率顯著提高，高達99%，而單獨使用膀胱鏡檢查的檢出率僅為91%[14]。另有研究表明，腫瘤的級別越高，階段越晚，NMP22靈敏度越高[15]。因此，NMP22尚不能取代膀胱鏡檢查在臨床中的作用，但通過NMP22檢測可以降低膀胱癌術(shù)后患者膀胱鏡檢查的頻率。此外，NMP22還適用于高級別膀胱癌的早期檢測。

1.2 膀胱腫瘤抗原

膀胱腫瘤抗原（bladder cancer antigen，BTA）是一種膀胱癌細胞產(chǎn)生的人補體因子H相關(guān)蛋白。BTA通過打斷補體級聯(lián)反應(yīng)，使腫瘤細胞具有選擇性生長優(yōu)勢，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)[16]。尿液BTA常用的檢測方法有兩種：BTAtrak是一種定量的ELISA檢測方法，BTAstat是一種快速特異性試驗。研究表明，BTAtrak檢測膀胱癌的靈敏度和特異度分別為66%和65%，而BTAstat的靈敏度為70%，特異度為75%[17]。兩種檢測方法的靈敏度均隨腫瘤級別的增加而提高，但特異度仍低于尿液脫落細胞學(xué)檢查[18]。大部分的假陽性結(jié)果是由血尿、良性前列腺增生、感染、炎性反應(yīng)、結(jié)石、卡介苗灌注史和腸道介入史導(dǎo)致的。因為這些良性疾病的干擾，導(dǎo)致BTA的特異度僅為56%[19]。目前BTA的價值有限，很少用于臨床決策。

1.3 免疫細胞試驗

免疫細胞試驗（ImmunoCyt test）是尿液脫落細胞學(xué)檢查和免疫熒光法的結(jié)合，使用3種熒光單克隆抗體檢測3種特異性膀胱腫瘤抗原：M344是一種高分子量的癌胚抗原，LDQ10和19A11是與膀胱腫瘤細胞相關(guān)的黏蛋白。該測試需要經(jīng)驗豐富的細胞病理醫(yī)師及大量的脫落細胞才能獲得準確的結(jié)果。當(dāng)觀察到1個紅色或綠色熒光時即為陽性細胞，但制造商建議所有陽性細胞應(yīng)與形態(tài)相關(guān)[20]。該測試被美國FDA批準用于對具有膀胱癌病史的患者進行監(jiān)測。在一項包含10項研究、4199例膀胱癌患者的系統(tǒng)回顧性研究中，ImmunoCyt檢測的總體靈敏度為84%，特異度為75%；在低級別的腫瘤中，ImmunoCyt檢測的靈敏度高于尿液脫落細胞學(xué)檢查[11]。在一項包含2217例膀胱癌患者的研究中，Immuno-Cyt檢測與尿液脫落細胞學(xué)檢查聯(lián)合時，總體靈敏度為73%，1級腫瘤為59%，2級腫瘤為77%，3級腫瘤為90%，但聯(lián)合檢測的特異度仍低于尿液脫落細胞學(xué)檢查（72%vs98%）[21]。研究表明，作為一種基于細胞的分析，與其他試驗相比，ImmunoCyt檢測受血尿和炎性反應(yīng)的影響較小[22]。在一項涉及1182例膀胱癌患者的多中心前瞻性研究中，這些患者既沒有膀胱癌病史，也沒有無痛性血尿史，ImmunoCyt檢測能夠很好地預(yù)測膀胱癌的發(fā)生[23]。盡管如此，ImmunoCyt檢測受樣品穩(wěn)定性及制備過程的影響，也受檢測者的主觀性影響，因此在臨床上較少使用。

1.4 熒光原位雜交技術(shù)

UroVysion是一種多靶點熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，能夠從尿液脫落細胞中鑒定出最常見的尿路上皮癌細胞3、7和17號染色體的非整倍性以及p16抑癌基因9p21位點的缺失。迄今為止，還沒有UroVysion試驗陽性的統(tǒng)一標(biāo)準，但是當(dāng)觀察到至少25個異常細胞中≥4個細胞出現(xiàn)以上染色體改變或≥12個細胞出現(xiàn)9p21位點的純合子缺失時，通常被認為陽性[24]。該測試已被美國FDA批準用于對有膀胱癌病史的患者進行監(jiān)測。在一項包含2477項FISH檢測的Meta分析中，UroVysion檢測膀胱癌的靈敏度為72%，優(yōu)于尿液脫落細胞學(xué)檢查，但特異度較低，僅有83%[25]。UroVysion試驗在膀胱癌的早期診斷和預(yù)后評估中具有無創(chuàng)、靈敏度和特異度高等優(yōu)點，是早期診斷及監(jiān)測UCB較為理想的手段，UroVysion試驗使用的探針可在同一細胞內(nèi)同時顯示4種遺傳學(xué)改變，在中國人群中診斷膀胱癌同樣具有較高的應(yīng)用價值。隨著此項技術(shù)的成熟及試劑成本的降低，相信UroVysion FISH在膀胱癌的早期診斷中將有著廣泛的應(yīng)用前景。

1.5 CxBladder

CxBladder是 基 于4種mRNA（IGFBP5、HOXA13、MDK、CDK1）在膀胱癌患者尿液中顯著增加的檢測，另一種mRNA（CXCR2）與炎性反應(yīng)相關(guān)，用來減少假陽性率，試驗中通過實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time-polymerase chain reaction，RT-PCR）評估這些mRNA的表達。在一項包括485例存在血尿而沒有膀胱癌病史的患者的前瞻性研究中，CxBladder檢測膀胱癌的靈敏度為82%，特異度為85%[26]。

1.6 纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物

纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（fibrin/fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP）是在纖溶亢進時產(chǎn)生的纖溶酶的作用下，纖維蛋白或纖維蛋白原被分解后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的總稱。腫瘤細胞表面存在多種纖溶酶原激活物受體，該受體與腫瘤細胞產(chǎn)生的纖溶酶原激活物結(jié)合，進而激活纖溶酶。激活的纖溶酶分解纖維蛋白原和纖維蛋白，從而產(chǎn)生大量的FDP經(jīng)尿液排出。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DP診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為64%和77%[27]。中國的一項研究運用乳膠凝集半定量測定法檢測尿液中FDP的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者中尿液FDP﹥4 μg/ml占88%，而正常對照組尿中FDP的含量極低，絕大多數(shù)﹤2 μg/ml[28]。

2 美國FDA未經(jīng)批準的膀胱腫瘤標(biāo)志物

2.1 膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白

膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白（bladder cancer spe-cific nuclear matrix protein，BLCA）于1996年由Van Le等[29]首先發(fā)現(xiàn)并報道，他們通過蛋白組學(xué)的方法提取膀胱癌組織，分別命名為BLCA1-4和BLCA-6。BLCA-4在泌尿系統(tǒng)良性疾病及泌尿系統(tǒng)其他惡性腫瘤中均未被檢測出。Konety等[30]采用更為先進的雙抗免疫夾心法在大樣本中進行檢測，獲得了類似的結(jié)果，膀胱癌檢測的靈敏度達89%，特異度達95%。BLCA-4除在膀胱癌組織中表達外，在鄰近腫瘤的正常黏膜中也有表達。Myers-Irvin等[31]檢測了BLCA-1在膀胱組織及尿液中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLCA-1在膀胱癌患者的尿液中特異性表達，而在前列腺癌及腎細胞癌患者的尿液中無表達。此外，與BLCA-4在膀胱癌旁正常黏膜中也有表達不同，BLCA-1僅在膀胱腫瘤細胞中表達，提示兩者在膀胱癌發(fā)生過程中的作用不同。對中國人群而言，尿液BLCA-1和BLCA-4均為具有高特異度及靈敏度的膀胱癌早期診斷標(biāo)志物。當(dāng)cut-off值設(shè)定為0.0009 OD/μg時，BLCA-1檢測膀胱癌可獲得良好的效能，靈敏度為92.7%，特異度為 92.9%；cut-off值取 0.00017 OD/μg時，BLCA-4檢測膀胱癌可獲得最好的效能，靈敏度為97.4%，特異度為100%。尿液BLCA-1檢測與膀胱癌的分期、分級無明顯相關(guān)性，而尿液中BLCA-4的檢測對MIBC更有價值[32]。

2.2 存活素mRNA

存活素mRNA是最新發(fā)現(xiàn)的一類凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis family of proteins，IAP）成員，可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。但與其他家族成員不同的是，存活素mRNA只包含一部分保守的輪狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)，而無羧基末端鋅指結(jié)構(gòu)。有研究顯示，存活素mRNA診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別高達85.71%和90.91%。同時，存活素mRNA的表達與腫瘤的臨床分期密切相關(guān)，對T1S～T1亞組患者的靈敏度僅為79.55%，明顯低于T2～T4亞組患者的100%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）[33]。說明存活素mRNA的表達水平隨著膀胱癌分化程度的降低而逐漸升高，影響腫瘤的惡性程度和發(fā)展趨勢。

2.3 細胞凋亡標(biāo)志物

2.3.1 可溶性Fas可溶性Fas（soluble Fas，sFas）是膀胱癌細胞產(chǎn)生和釋放的抗凋亡蛋白，可以干擾Fas配體間的相互作用，抑制腫瘤細胞凋亡。sFas在尿液中的水平已被證明是膀胱癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子[34]。在一項納入191例膀胱癌患者的研究中，sFas診斷的靈敏度和特異度分別為88%和89%[35]。與NMP22相比，sFas似乎可以更好地預(yù)測膀胱癌及其侵襲能力。

2.3.2 叢生蛋白 叢生蛋白（clusterin）是一種多功能的分泌糖蛋白，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明，clusterin表達水平在膀胱癌患者的尿液中明顯升高[36]。另有研究報道，clusterin診斷膀胱癌的靈敏度為70%～87%，特異度為83%～97%[37]。

2.4 血管生成標(biāo)志物

2.4.1 血管內(nèi)皮生長因子 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是膀胱癌細胞血管生成的重要介質(zhì)，在促進腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用。VEGF水平與膀胱癌存在相關(guān)性，且隨著腫瘤級別的增加而增加。VEGF可能通過旁分泌作用于內(nèi)皮細胞，刺激內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，增加血管通透性，促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。因此，隨著膀胱癌病理分級與臨床分期的增加，VEGF表達水平升高，血管生成能力增強。有研究顯示，VEGF診斷膀胱癌的靈敏度為68%～83%，特異度為62%～93%[38]。

2.4.2 白細胞介素 白細胞介素（interleukin，IL）是由白細胞分泌的小信號蛋白，參與免疫系統(tǒng)的炎性反應(yīng)過程。膀胱癌患者尿液中IL-8的水平明顯升高，在普通檢測環(huán)境中，IL-8檢測表現(xiàn)出較高的準確性，在灌注卡介苗后的監(jiān)測環(huán)境中，經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)的患者尿液中IL-8的水平更高[39]。IL-6/IL-10已被證明可以預(yù)測卡介苗應(yīng)用后的復(fù)發(fā)和中度風(fēng)險患者的復(fù)發(fā)，靈敏度為83%，特異度為76%[40]。雖然血管生成和炎性反應(yīng)是腫瘤的明確標(biāo)志，但它們是非特異性的，因此對膀胱癌的診斷或監(jiān)測意義不大。

2.5 增殖與侵襲相關(guān)標(biāo)志物

2.5.1 端粒酶 端粒酶是真核細胞染色體末端具有穩(wěn)定DNA序列和防止染色體復(fù)制時縮短的功能性異質(zhì)化結(jié)構(gòu)，對于防止染色體畸變和維持下游基因遺傳信息的穩(wěn)定具有重要意義。端粒酶在絕大多數(shù)正常體細胞中呈失活狀態(tài)，但在膀胱癌發(fā)生過程中可被重新激活。目前主要通過端粒重復(fù)序列擴增技術(shù)和PCR技術(shù)檢測端粒酶[41]。由于端粒酶活性缺乏特異性，導(dǎo)致其假陽性率較高。

2.5.2 透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸是組成細胞外基質(zhì)的一種黏多糖，與細胞黏附和增殖有關(guān)。透明質(zhì)酸可被透明質(zhì)酸酶降解成促進血管生成的小片段。兩種成分在膀胱癌患者的尿液中都有增加。兩者結(jié)合后，測試性能優(yōu)于單獨測試，靈敏度為92%，特異度為85%[42]。透明質(zhì)酸/透明質(zhì)酸酶的水平與腫瘤級別相關(guān)[43]，但還需要進一步的研究來評估該生物標(biāo)志物的臨床效應(yīng)。

2.5.3 纖維粘連蛋白 纖維粘連蛋白是一種結(jié)構(gòu)糖蛋白，廣泛存在于細胞、血漿和細胞外基質(zhì)中，與細胞的遷移和黏附有關(guān)。當(dāng)出現(xiàn)腫瘤時，細胞外基質(zhì)的組成部分被蛋白酶降解，為腫瘤的轉(zhuǎn)移或侵襲創(chuàng)造條件。在一項納入5項研究、649例患者和291個對照組的Meta分析中，纖維粘連蛋白檢測膀胱腫瘤的靈敏度為81%，特異度為80%[43]。

2.6 基因相關(guān)生物標(biāo)志物

2.6.1 成纖維生長因子受體 3成纖維生長因子受體 3（fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）突變可以出現(xiàn)在50%以上的膀胱癌患者中，F(xiàn)GFR3突變是膀胱癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子[44]。在低級別膀胱腫瘤中，F(xiàn)GFR3檢測的靈敏度為58%，高于尿液脫落細胞學(xué)檢查[45]。FGFR3檢測具有多種用途，包括腫瘤的檢測、藥物作用的靶點檢測和監(jiān)測治療反應(yīng)等。

2.6.2 DNA甲基化 在腫瘤形成的過程中常常伴有DNA異常甲基化。很多基因的CpG島異常甲基化伴隨著膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，在膀胱癌組織標(biāo)本和患者尿液標(biāo)本中能檢測出多種基因的異常甲基化。Reinert等[46]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對184例非浸潤性膀胱癌患者的390份尿沉渣細胞的EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM和ZNF154基因的甲基化水平進行檢測，靈敏度為82%～89%，特異度為94%～100%。目前甲基化機制在表觀遺傳學(xué)中的研究較為深入，很多抑癌基因的異常甲基化參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

2.6.3 微RNA 微RNA（microRNA，miRNA）是一種小型的非編碼RNA，通過結(jié)合mRNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達。miRNA表達的改變可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，并可通過RT-PCR測量，一些miRNA沉默的表觀遺傳改變已經(jīng)顯示參與膀胱癌的發(fā)展。研究表明，miRNA-137、miRNA-124-2、miRNA-124-3、miRNA-9-3檢測膀胱癌的靈敏度為81%，特異度為89%[47]。

3 小結(jié)

膀胱鏡檢查和活體組織檢查是臨床推薦的診斷膀胱癌最可靠的方法，但具有侵入性且費用昂貴。因此，作為膀胱鏡檢查及活體組織檢查的補充，通過尿液腫瘤標(biāo)志物輔助檢查可以提高膀胱癌的檢出率，為膀胱癌的診斷提供安全、簡單、無創(chuàng)的檢查手段。