李朋朋　侯林

摘要：參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015版（后簡(jiǎn)稱獸藥典）一部附錄200頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的有關(guān)規(guī)定，對(duì)加米霉素注射液內(nèi)毒素限度及檢查方法進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，加米霉素注射液在0.075～0.3mg/mL時(shí)對(duì)鱟試劑無(wú)增強(qiáng)或抑制作用，產(chǎn)品內(nèi)毒素含量均小于限定值125EU/mL，符合規(guī)定。通過試驗(yàn)研究，建立了加米霉素注射液的內(nèi)毒素檢查方法，且采用凝膠法對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

關(guān)鍵詞：加米霉素注射液；內(nèi)毒素檢查；干擾試驗(yàn)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法又稱鱟試驗(yàn)法，它與傳統(tǒng)家兔熱原檢查法相比，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在獸用注射液質(zhì)量控制中的應(yīng)用越來越廣泛。加米霉素注射液屬于動(dòng)物專用的半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，法國(guó)梅里亞公司的Zactran已被我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口注冊(cè)。筆者參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015版（下稱獸藥典）一部附錄200頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對(duì)加米霉素注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究，為該產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查提供依據(jù)。

1試驗(yàn)材料

1.1鱟試劑

鱟試劑，靈敏度（λ）為0.25EU/mL，0.1mL/支，批號(hào)161118，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；鱟試劑，靈敏度為0.25EU/mL，0.5mL/支，批號(hào)1605270，湛江安度斯生物有限公司。

1.2細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，80EU/支，批號(hào)201784，中國(guó)藥品生物制品檢定院。

1.3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

檢查用水，5mL/支，批號(hào)161004，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。

1.4儀器與耗材

除熱原槍頭：200μL、1000μL；除熱原鋁蓋玻璃試管：10×75mm、13×100mm，無(wú)熱原空安瓿：2mL，以上耗材均購(gòu)自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。MS3B$25渦旋混勻器，IKA?？烧{(diào)微量移液器：量程為10～100、20～200和100～1000μL，Eppendorf Research型，

德國(guó)Eppendorf公司。試管恒溫儀，TAL-40D型，湛江安度斯生物有限公司。

1.5試驗(yàn)藥品

加米霉素注射液，含量：150mg/mL，規(guī)格10mL/支，批號(hào)為20141101、20141102、20141103、20171201、20171202、20171203，由洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司提供。

2方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，并配制成含內(nèi)毒素為2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ系列濃度的溶液，依法進(jìn)行加樣操作。每一濃度平行做4支，同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對(duì)照，記錄結(jié)果，并按式λc=antilg（∑^X/4）計(jì)算λ_c值，結(jié)果見表1。由表1數(shù)據(jù)可知三種鱟試劑的復(fù)核靈敏度λ均在0.5～2λ之間，表明這三種鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。

2.2細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定

根據(jù)公式L=K/M計(jì)算加米霉素注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值，其中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值，注射劑的K值為5EU/（kg·h），M為每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量。加米霉素注射液臨床推薦劑量為6mg/（kg·bw），由此可知本品每小時(shí)最大使用劑量亦為6mg/（kg·bw），所以其M為6mg/（kg·bw），按照注射液含量折算為M=0.04mL/kg，進(jìn)而求得加米霉素注射液內(nèi)毒素限值為125EU/mL。

2.3干擾預(yù)試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)參考設(shè)計(jì)干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)。由于現(xiàn)有鱟試劑的靈敏度在0.06～0.5EU/mL之間，因此樣品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD=L/λ=250～2000倍，采用不超過最大有效稀釋倍數(shù)的溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)。取加米霉素注射液（批號(hào)為20141101），無(wú)菌操作，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075mg/mL系列濃度，依法操作試驗(yàn)。結(jié)果見表2。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，加米霉素注射液在0.075～0.3mg/mL時(shí)，NPC（供試品）系列溶液對(duì)鱟試劑反應(yīng)均為陰性，PPC（供試品陽(yáng)性）系列溶液均為陽(yáng)性，表明加米霉素注射液配制成≤0.3mg/mL的稀釋液時(shí)對(duì)鱟試驗(yàn)反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.4正式干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定正式干擾試驗(yàn)中樣品的濃度為0.3mg/mL。取供試品3批，無(wú)菌操作，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品稀釋成0.3mg/mL（即500倍稀釋），依法檢查，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示當(dāng)供試品配制為0.3mg/mL濃度時(shí)，Es在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，Et均在0.5～2.0Es范圍內(nèi)，表明20141101、20141102、20141103三批供試品配制為0.3mg/mL濃度時(shí)，用2個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑試驗(yàn)均無(wú)干擾作用。

2.5樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取供試品，依法考察了6批加米霉素注射液的內(nèi)毒素限值，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知6批供試品中，每1 mL的加米霉素注射液含內(nèi)毒素的量均小于125EU。

3討論

在進(jìn)行上述試驗(yàn)過程中，陽(yáng)性對(duì)照管不發(fā)生凝集的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，后經(jīng)查找原因，最終確定是因?yàn)榉跤郎囟炔粔蚣安僮鳒囟冗^高造成的。通過嚴(yán)格控制孵育溫度，并在必要時(shí)改為冰浴操作，陽(yáng)性對(duì)照不成立現(xiàn)象明顯改善。另外，雖然鱟試劑不能劇烈震蕩，但當(dāng)內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液與復(fù)溶后的鱟試劑混合時(shí)，應(yīng)輕緩震動(dòng)混勻，否則也易造成陽(yáng)性管不凝集現(xiàn)象。因此鱟試驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格控制孵育溫度、孵育時(shí)間及操作速度，并確保鱟試劑與內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻。

本試驗(yàn)用兩個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)加米霉素注射液3個(gè)批號(hào)進(jìn)行了干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明加米霉素注射液在0.3mg/mL稀釋液濃度下沒有干擾作用，可進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。另外，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定加米霉素注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法為：取待測(cè)樣品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至每1mL含0.3mg的溶液，依法檢查，每1mL加米霉素注射液含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于125EU。

從表4結(jié)果可知供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均符合規(guī)定，因此該注射液在當(dāng)前制定的內(nèi)毒素限值下，采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。