王晶晶 張 杰 盧 靜

(1. 首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 100069)(2. 首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院臨床流行病學北京市重點實驗室，北京 100069)

心力衰竭(heart failure，HF)是各種嚴重心臟疾病共有的一個主要并發(fā)癥或“最后共同通道”。心力衰竭患者一旦出現(xiàn)典型癥狀，病情將進行性加重，死亡率與惡性腫瘤病人相仿[1-2]，但目前對于其機制、診斷和治療的認識還遠遠不夠。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)心肌細胞的不正常凋亡在心衰中起著重要的作用[3-4]。同時發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是使心肌細胞不正常凋亡的新途徑。本實驗通過建立大鼠急性心肌梗死模型,觀察心肌梗死后心力衰竭大鼠8周內內質網(wǎng)特異性分子伴侶的表達變化與心衰大鼠心肌細胞凋亡的關系,探討急性心肌梗死后大鼠心力衰竭的過程中，內質網(wǎng)應激在心肌細胞凋亡中的作用，從而為心衰病人的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量200～220 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001；飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2013-0004。

動物經適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為假手術組，手術組。假手術組僅進行開胸手術，不結扎冠脈，隨機分0周組、2周組、4周組、6周組、8周組，每組存活動物不低于5只。手術組根據(jù)參考文獻[5-7]的方法，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，肢體導聯(lián)出現(xiàn)1個明顯的ST段弓背抬高，心肌梗死模型成功，模型成功率為98%。手術組術后隨機分為術后2周組、4周組、6周組、8周組共4組，每組存活動物不低于5只。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNA反轉錄試劑盒(Promege公司)，QPCR試劑盒(ABI公司)、引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

EL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司，國產)，熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司，IQ5美國)、高速冷凍離心機(Thermo公司，德國)。

1.3 方法

1.3.1血流動力學指標測定：分別測定假手術組各組在0周、2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)；測定手術組術后2周組、術后4周組、術后6周組、術后8周組大鼠在2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)。

1.3.2心肌組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA：手術組術后2周組、4周組、6周組、8周組大鼠分別于術后2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織；假手術組大鼠分別在0周、2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織。采用Trizol試劑[6-7]分別提取假手術組各組大鼠、手術組各組大鼠的心肌組織中總RNA，利用RNA反轉錄試劑盒將心肌總RNA反轉錄為cDNA。

1.3.3引物設計：引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因組序列，利用生物學軟件Primer5.0自行設計。

表1 引物序列

1.3.4熒光定量PCR法(QPCR)測定Caspase-3, Caspase-12, Bcl-2，CHOP, GRP78在心肌組織中的的表達量：利用QPCR反應試劑盒(SYBR GREEN法)采用20 μL反應體系。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min，95℃10 s，55℃30 s，40個循環(huán)。PCR產物應用隨機軟件進行分析得到相關的光密度值。每個樣本做3平行樣，最后取基因或蛋白的光密度值與相應的β-actin光密度值的比值進行分析。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間的數(shù)據(jù)比較采用S-N-K 檢驗，蛋白及基因的表達量與時間的相關性分析采用Speaman相關。檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 血流動力學測定

假手術組大鼠2、4、6、8周的血流動力學各項指標與該組0周時的相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見表2；手術組大鼠的心率隨著飼養(yǎng)時間的增長逐漸加快，術后2周、4周、6周、8周組大鼠左心室收縮壓(LVSP)與假手術組的相比有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)；手術組大鼠術后2周、4周、6周、8周組的左心室收縮壓(LVEDP)與假手術組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)；手術組術后2周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，手術組大鼠術后4周、6周、8周組與假手術組的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)；手術組術后2周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，手術組大鼠術后4周、6周、8周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比有顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)，結果見表3。

2.2 不同組的大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78的表達

手術組大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-12的表達量隨著飼養(yǎng)時間的延長表達量增加，與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)；手術組大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-3的表達量隨著飼養(yǎng)時間的延長表達量增加，術后4、6周組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，術后2、8周與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)；大鼠手術組術后2、4、6、8周組心肌組織中Bcl-2的表達量隨著術后飼養(yǎng)時間的延長而降低，2、4、6、8周組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義P≤0.01)；大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中CHOP的表達量隨著飼養(yǎng)時間的延長表達量增加，術后2、4周組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)，術后6、8周組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)；大鼠手術組術后2、4、6、8周組心肌組織中GRP78蛋白的表達量隨著飼養(yǎng)時間的延長表達量增加，術后6周組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)；術后8周組心肌組織中的GRP78蛋白含量與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)，結果見表4。

表2 假手術組大鼠不同時間的血流動力學檢測結果

注：A：與假手術組比P≤0.05； AA：與假手術組比P≤0.01 Note：A:P≤0.05vssham group, AA:P≤0.01vssham group

表4 各組大鼠心肌組織基因/蛋白含量表達

注：A：與假手術組比P≤0.05； AA：與假手術組比P≤0.01 Note：A：P≤0.05vssham group，AA：P≤0.01vssham group

2.3 術后飼養(yǎng)2、4、6、8周與手術組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78含量的相關性

手術組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3，CHOP, GRP78的表達量隨著術后飼養(yǎng)時間的增長而增加，其表達量與時間呈正相關，心肌組織中Bcl-2的表達量隨著術后飼養(yǎng)時間的增長而減低，其表達量與時間呈負相關，結果見表5。

表5 大鼠術后飼養(yǎng)時間與大鼠心肌組織中蛋白/基因表達量的相關性

3 討論

心力衰竭是心臟結構與功能嚴重減退的臨床表現(xiàn)，然而對心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展機制仍未完全闡明。急性心肌梗死后心肌細胞的死亡會導致心室重塑和心力衰竭，而心室重構的發(fā)生與心肌細胞凋亡又有著重要聯(lián)系。研究顯示心肌細胞凋亡在心肌梗死后心室重塑和心衰發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而心肌細胞凋亡與內質網(wǎng)應激的發(fā)生又密切相關[8-9]。

內質網(wǎng)是廣泛存在于真核細胞內的重要細胞器，當機體受到如缺氧、中毒、電解質酸堿平衡紊亂等刺激時，其相應的跨膜信號傳導蛋白將會被激活，破壞內質網(wǎng)內環(huán)境的穩(wěn)定，抑制內質網(wǎng)蛋白質合成功能，誘導細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激[10-11]。內質網(wǎng)應激早期,是通過激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)保護由ERS引起的細胞損傷，恢復細胞功能恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細胞的正常功能并使之生存，是細胞的一種自我保護性機制。

UPR是由內質網(wǎng)分子伴侶GRP78/Bip (glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein)和內質網(wǎng)上PERK、ATF6、IRE1應激感受蛋白所介導發(fā)生的。正常情況下GRP78與PERK、ATF6、IRE1連接呈無活性狀態(tài)，當內質網(wǎng)內積聚大量未折疊蛋白時,GRP78與三者解離，激活PERK、ATF6、IRE1，啟動UPR反應，從而對細胞起到保護作用。因此GRP78在應激條件下對細胞起保護作用,而它的誘導產生則被廣泛用于標志ERS和UPR的發(fā)生[12]。

本實驗中發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死后心力衰竭的大鼠心肌組織中GRP78蛋白持續(xù)表達，并隨著術后飼養(yǎng)時間的延長，心力衰竭的嚴重程度增強。這說明在急性心肌梗死到心力衰竭的病理過程中內質網(wǎng)應激反應被激活。這可能是由于急性心肌梗死的大鼠在發(fā)展成慢性心力衰竭的過程中，隨著大鼠心肌細胞的缺血，心臟輸出量降低，心臟功能減弱，使得內質網(wǎng)負荷逐漸加重，從而誘導了ERS和UPR反應的發(fā)生。

大鼠在發(fā)生急性心肌梗死后發(fā)展到心力衰竭的過程中，體內的ERS持續(xù)存在，過強或過久的ESR，使得UPR的保護作用不能與ESR帶來的損傷相抗衡。由于不能通過UPR的啟動恢復細胞正常功能，內質網(wǎng)上與ERS相關的跨膜蛋白信號將會激活下游的凋亡信號分子：Caspase-12，GADD153/CHOP(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153或C/EBP homologous protein)，從而導致心肌細胞凋亡[13]。已有的研究表明，內質網(wǎng)應激是除了線粒體外，另一條誘導細胞凋亡的新途徑，過強的或長時間的ERS反應可以引起細胞凋亡[14-15]。

Caspase-12是內質網(wǎng)膜獨有的蛋白水解酶，特異性結合于內質網(wǎng)膜上。正常情況下以無活性的前提存在，當發(fā)生ESR時Caspase-12被激活，進而激活下游的Caspase-3，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生。實驗證明Caspase-12是內質網(wǎng)應激誘導凋亡的特異性分子，是不通過線粒體凋亡途徑的獨立信號轉導途徑介導細胞凋亡的[15-16]，因此可以把Caspase-12的活化作為ERS途徑細胞凋亡的標志[15]。

而GADD153/CHOP是b-ZIP轉錄因子,屬于CCAATP增強子連接蛋白的轉錄因子C/EBP家族，在正常生理狀態(tài)下CHOP基本檢測不到，當內質網(wǎng)應激持續(xù)時間過長或程度過重時，其活性被顯著激活，引發(fā)高水平的ERS[16]。 因此CHOP是內質網(wǎng)應激的標志，它是是通過下調Bcl-2表達、耗竭谷胱甘肽、促進反應氧族產生等導致細胞凋亡。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心力衰竭的大鼠術后2周、4周、6周、8周組的心肌組織中Caspase-3,Caspase-12，CHOP 的表達量隨著術后飼養(yǎng)時間的延長，心力衰竭的嚴重程度而增加。Bcl-2的表達量隨著術后飼養(yǎng)時間的延長，心力衰竭的嚴重程度而減少。這說明大鼠從心肌梗死發(fā)展到心力衰竭的過程中，內質網(wǎng)上始終有ESR的發(fā)生。持續(xù)存在的ESR，使與內質網(wǎng)相關的凋亡信號分子被激活，引發(fā)心肌細胞凋亡，并使細胞凋亡貫穿于心肌梗死到心力衰竭的整個過程。

綜上所述，大鼠從急性心肌梗死發(fā)展到心力衰竭的病理生理過程誘導了內質網(wǎng)應激的發(fā)生，持續(xù)、嚴重的內質網(wǎng)應激激活了與內質網(wǎng)應激相關的細胞凋亡通路，使得心肌細胞凋亡。提示ERS參與了大鼠從急性心肌梗死到心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程。內質網(wǎng)應激誘導的心肌細胞凋亡作用可能是心肌梗死后導致心力衰竭發(fā)生的機制之一。