顏朦朦，佘永新,*，洪思慧，張 超，曹曉林，王猛強，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，邵 華，金 芬，劉海金，王 靜,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.西藏自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，西藏 拉薩 850009）

隨著社會的發(fā)展、科技的進步，食品安全問題越來越受到重視，其安全因素（農(nóng)藥、獸藥、生物毒素、微生物等）[1-2]引發(fā)的安全事件屢見不鮮；因此為保證食品安全并滿足人們的需求就必須進行監(jiān)管監(jiān)測，多種檢測方法已得到應(yīng)用，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3-4]、高效液相色譜[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6]等儀器檢測法，這些技術(shù)雖然靈敏且精確，但是花費時間長、需要專業(yè)的培訓(xùn)以及昂貴的儀器。其中也包括相對簡單快捷的檢測技術(shù)，如免疫學(xué)方法（酶聯(lián)免疫反應(yīng)分析技術(shù)[7]等），但其使用的生物材料都比較昂貴，并且需要繁瑣的洗滌步驟，耗費大量試劑，對環(huán)境造成污染。因此，一種簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)需要應(yīng)用到食品安全檢測中。

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是利用金屬薄膜光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理光學(xué)現(xiàn)象檢測物質(zhì)的技術(shù)，自1902年由Wood發(fā)現(xiàn)，至今已有100多年的歷史。其具體原理如下：當(dāng)一束偏振光在一定的角度范圍內(nèi)入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬薄膜（Au或Ag）的界面將產(chǎn)生表面等離子波，當(dāng)入射光的傳播常數(shù)與表面等離子波的傳播常數(shù)相匹配時，引起金屬膜內(nèi)自由電子產(chǎn)生共振，即SPR[8]。分析時，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金屬表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角度的變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學(xué)常數(shù)和特異性等信息。SPR技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、能夠?qū)崟r監(jiān)測反應(yīng)的動態(tài)過程，只需對樣品進行簡單的預(yù)處理，無需標(biāo)記，耗樣量少，檢測時間短等[9-11]優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域，如生命科學(xué)[12-13]、醫(yī)藥學(xué)[14-15]、環(huán)境監(jiān)測[16-17]等，并逐漸應(yīng)用到食品安全[18-19]檢測中。其中SPR傳感器中的分子識別元件是其重要組成部分，它決定檢測方法的特異性，本文主要從不同種類的識別元件技術(shù)簡要綜述近10 年來SPR傳感器技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用。

1 識別元件

1.1 抗體

利用抗體作為識別分子檢測農(nóng)藥是目前世界上應(yīng)用最廣、最普遍的檢測方法。隨著科技的發(fā)展，此識別分子更廣泛地應(yīng)用到農(nóng)藥的檢測，并且其檢測限不斷降低，檢測范圍不斷增大，本文總結(jié)了近幾年的研究文獻（表1），其傳統(tǒng)的檢測方法主要包括競爭法、直接法及夾心法。

表1 基于抗體識別元件的SPR傳感器在農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用Table1 Applications of SPR sensors based on antibody recognition elements in agricultural product detection

競爭法是指先在SPR傳感器芯片上固定半抗原-蛋白復(fù)合物，然后加入靶標(biāo)及固定濃度的抗體混合液，競爭法是半抗原與靶標(biāo)同時競爭抗體的方法，當(dāng)靶標(biāo)濃度升高時，金屬表面的抗原-抗體濃度就減小，SPR響應(yīng)信號強度相應(yīng)減小，靶標(biāo)濃度與SPR信號強度成反比，是農(nóng)藥檢測中最常用的方法（圖1）。如2007年Mauriz等[20]利用競爭法同時檢測雙對氯苯基三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）、西維因、毒死睥3 種農(nóng)藥，并且都能達到較低檢測限，分別為18 ng/L、0.05 μg/L、52 ng/L。夾心法是將抗體首先固定在芯片表面，然后加入抗原，與抗體結(jié)合，然后再加入二抗，以增加SPR的響應(yīng)信號強度，靶標(biāo)濃度與SPR信號強度成正比，此方法在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用較少。在2001年Shimomura等[21]利用夾心法進行了阿特拉津的檢測，在5 ng/mL的阿特拉津樣品中檢測到信號放大比率為1.9（圖2）；類似的，Wu Xuli等[22]通過SPR分別以5.54 ng/mL和0.77 ng/mL的檢測限同時檢測牛奶和花生中過敏原：β-乳球蛋白及花生蛋白Ara h1。Ashley等[23]采用了由4 個感測陣列組成的SPR傳感器芯片，傳感器芯片使用EDC/NHS偶聯(lián)方法固定α-酪蛋白多克隆抗體。首先優(yōu)化和測定傳感器的性能，并在純緩沖液條件下進行表征，得到作為直接結(jié)合測定的檢測限為58 ng/mL。通過使用夾心測定形式并用納米顆粒信號增強，應(yīng)該可以進一步提高測定靈敏度，但是在此傳感器上并沒有達到增加靈敏度的效果。傳感器表現(xiàn)出對α-酪蛋白的良好選擇性，并且獲得了足夠的回收率。直接檢測法主要應(yīng)用在大分子上，Yakes等[24]在SPR芯片上固定單克隆抗體，其檢測通道分為單通道及多通道（可以同時檢測96 個樣品），并且與成熟的酶聯(lián)免疫檢測方法相比較，3 種方法同時檢測貝類組織的多糖酸，多通道原型儀器于2 h內(nèi)完成，單通道為12 h，酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）為24 h以上，很好地提高了工作效率。類似的，Zhang Xiaoguang等[25]通過直接固定抗體在芯片上實現(xiàn)了對大腸桿菌、沙門氏菌和李斯特菌的同時檢測。為了實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，Pan Qi等[26]構(gòu)建了便攜式掃描SPR生物傳感器，用于食品的安全檢測，并用瘦肉精作為樣品，該方法和裝置的有效性通過了實驗證明。

圖1 競爭法簡易原理圖Fig.1 Schematic diagram of the competitive method

圖2 夾心法簡易原理圖[21]Fig.2 Schematic diagram of the sandwich method[21]

隨著納米材料的發(fā)展，其也應(yīng)用到SPR傳感器中，它可以有效地增強SPR響應(yīng)信號，提高對靶標(biāo)檢測的靈敏度。Yan Fufeng等[27]通過羧基改性石墨烯，實現(xiàn)了鹽酸克倫特羅的高靈敏度檢測。首先將山羊抗小鼠抗體與1-十八烷硫醇（1-octadecanethiol，OTD）改性的羧基-石墨烯綴合，然后通過自組裝沉積在OTD改性的金表面上，原理如圖3所示。為了了解這3 種方法的優(yōu)劣，Charlermroj等[28]以瓜氨酸為模型，并且將羧甲基化傳感器芯片C1及羧甲基化葡聚糖芯片CM5進行了比較，結(jié)果表明C1BI C5有更好的靈敏度，同時，直接檢測法表現(xiàn)出最佳的靈敏度，最后對西瓜進行了實際樣品分析，得到較好的回收率。Liu Xia等[29]將Fe3O4磁性納米粒子固定在芯片表面并且其表面用羧基基團進行修飾，以利于納米粒子與靶標(biāo)抗體的結(jié)合，然后引入靶標(biāo)，靶標(biāo)結(jié)合到納米粒子表面的抗體上，此時由于納米粒子的存在，SPR信號在同種靶標(biāo)濃度下的信號將會增強，從而達到提高檢測限的目的，利用該技術(shù)對溴氰菊酯進行了檢測，檢測限可以達到0.01 ng/mL。另外此帶有抗體的磁性納米粒子還可以對含有溴氰菊酯復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品或食品樣品進行靶標(biāo)的純化與富集，從而提高檢測的精確度。2017年，Daems等[30]首次使用自動光纖（fiber optic，F(xiàn)O）-SPR生物傳感器，在復(fù)雜生物樣品中量化小分子（如黃體激素）。其原理如圖4所示，從FO-SPR生物傳感器（A）開始，通過活化的羧基將孕酮-牛血清白蛋白（P4-bovine serum albumin，P4-BSA）共價固定在具有羧基的金涂層纖維的表面上（B），溶液中的游離P4和FO-SPR傳感器上固定的P4-BSA競爭檢測抗體（抗P4）。該信號由用山羊抗小鼠抗體功能化的Au納米顆粒（nanoparticle，NP）增強。此外，開發(fā)的生物測定法與商業(yè)化ELISA法比較，顯示出良好的一致性。利用相同原理，Hu Weihua等[31]實現(xiàn)了對黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮3 種典型霉菌毒素的高度特異性和靈敏度同時檢測，檢測限分別為8、30、15 pg/mL。

圖3 基于功能化石墨烯的SPR芯片簡易圖[27]Fig.3 Schematic diagram of SPR chip based on functionalized grapheme[27]

圖4 FO-SPR生物測定的概述圖[30]Fig.4 Schematic diagram of FO-SPR[30]

1.2 適配體

適配體（aptamer，Apt）是具有30～40 個核堿基的短寡核苷酸（RNA或單鏈DNA（ssDNA）），不需要動物或細胞培養(yǎng)，具有靶標(biāo)-寡核苷酸的結(jié)合特異性。適配體對其靶標(biāo)具有高親和力，其解離常數(shù)（Kd）在nmol～pmol范圍[49]。此外，通常適配體折疊成獨特的三維結(jié)構(gòu)，其允許特異性結(jié)合靶向分析物，因此適配體通過互補形式而不是其序列與靶標(biāo)相互作用。適配體具有許多優(yōu)點，例如它們具有很好的熱穩(wěn)定性并可重復(fù)使用，并且它們可以容易地通過引入功能分子（例如熒光團或酶）和官能團而被修飾[50]。這種化學(xué)修飾可以增強目標(biāo)分析物的穩(wěn)定性、親和性、特異性和功能性。此外，其具有優(yōu)于抗體的多功能性和避免動物在其生產(chǎn)中使用的特點，并且還具有較高的受體表面密度。因此，適配體在生物傳感器中作為識別元件已得到廣泛的應(yīng)用。使用者可以結(jié)合各種目標(biāo)分析物，如毒素[51]、抗生素[52]和生物標(biāo)志物[53]等，近年來基于適配體的SPR傳感器在食品安全檢測中也逐漸被應(yīng)用（表2）。2015年，Zhu Zhiling等[54]報道了基于適配體的SPR傳感器，將其用于赭曲霉毒素A的快速、準(zhǔn)確、高靈敏度檢測，將鏈霉親和素作為交聯(lián)劑固定在傳感器芯片的表面上，并通過鏈霉親和素-生物素相互作用捕獲生物素適配體，然后適配體捕獲靶標(biāo)分子，從而達到檢測的目的，該傳感器的檢測范圍為0.094～100.000 ng/mL，檢測限為0.005 ng/mL，通過簡單的液-液萃取樣品前處理方式檢測葡萄酒和花生油中的赭曲霉毒素A，添加回收率為86.9%～116.5%，變異系數(shù)為0.2%～6.9%。同理，Janardhanan等[55]用RNA適配體進行肉毒桿菌神經(jīng)毒素的檢測，使用解毒重組型A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素作為替代物，用適配體傳感器在90 min內(nèi)檢測活性毒素，磷酸鹽緩沖液、胡蘿卜汁和無脂牛奶中的檢測限分別為5.8、20.3 ng/mL和23.4 ng/mL，5 倍稀釋的人血清中的檢測限為22.5 ng/mL。為了提高檢測靈敏度，Lei Pinhua等[56]將改進的不對稱聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)整合到SPR傳感器芯片的表面中，其原理如圖5所示，首先用硫醇化探針對傳感器的金膜進行修飾，然后誘導(dǎo)靶序列和信號放大單元的鏈霉親和素適配體形成夾層結(jié)構(gòu)，如果添加沙門氏菌，則SA適配體與SA形成復(fù)合物，然后通過PCR技術(shù)實現(xiàn)信號放大，從而達到提高檢測靈敏度的目的。與以上原理不同的是，Tran等[57]利用膠體金顆粒實現(xiàn)信號放大（圖6），首先將所選擇的適配體固定在芯片上。然后，將FO-SPR傳感器浸入具有多克隆二抗的緩沖液中，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。在這些抗體與花生過敏原Ara h1蛋白結(jié)合后，將FO-SPR探針浸入含有被蛋白A修飾的Au NPs的溶液中，蛋白A是對抗體的FC部分具有高親和力，在該測定中應(yīng)用Au NPs以進一步增強信號。

表2 基于適配體識別元件的SPR傳感器在農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用Table2 Applications of SPR sensors based on aptamer recognition elements in agricultural product detection

圖5 基于PCR信號放大的SPR原理示意圖[56]Fig.5 Schematic diagram of signal amplification of SPR based on PCR[56]

圖6 基于AuNPs信號放大的SPR原理示意圖[57]Fig.6 Schematic diagram of signal amplification of SPR based on AuNPs[57]

1.3 分子印跡聚合物

分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）是以目標(biāo)分子為模板分子（原子、離子、分子、復(fù)合物、大分子以及微生物等），將具有結(jié)構(gòu)上互補的功能化聚合物單體通過某種作用力（非共價作用、電子或離子作用、共價作用以及金屬配位作用等）與模板分子結(jié)合，并加入交聯(lián)劑進行聚合反應(yīng)，反應(yīng)完成后將模板分子洗脫出來，形成的一種具有固定空穴大小、形狀及有確定排列功能團的交聯(lián)高聚物（圖7）[58]。分子印跡聚合物是通過體外化學(xué)合成的，具有結(jié)構(gòu)可預(yù)測性、高度的專一性、較好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性[59-60]。分子印跡聚合物已廣泛應(yīng)用于固相萃取技術(shù)、色譜技術(shù)及傳感器檢測技術(shù)。在檢測技術(shù)方面，可用于多種領(lǐng)域靶標(biāo)分子的檢測[61-63]，如醫(yī)藥、臨床診斷、食品安全與環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。關(guān)于分子印跡聚合物在SPR檢測方法中作為識別分子對農(nóng)藥檢測的研究已經(jīng)逐步發(fā)展，由于分子印跡聚合物的高度專一性及SPR技術(shù)的快速反應(yīng)性、高度敏感性及無需標(biāo)記性，得到不錯的研究成果，如表3所示。2016年Shrivastav等[64]報道了一種基于光纖維及生物分子印跡聚合物的SPR生物傳感器，并成功應(yīng)用于丙溴磷的檢測，其檢測限（limit of detection，LOD）可達到2.5×10-6μg/L，檢測范圍為10-4～10-1μg/L，其原理是：首先將銀鍍在多模光纖上，然后在銀膜表層涂上針對丙溴磷的分子印跡聚合物，當(dāng)丙溴磷引入時，可與分子印跡聚合物結(jié)合，并改變其折射率，SPR可以快速準(zhǔn)確地捕捉到這種變化，隨著靶標(biāo)濃度的不同，其折射率變化不同，從而達到不同濃度靶標(biāo)物質(zhì)的檢測（圖8）。利用相同原理，Atar[65]及Shaikh[66]等分別選用不同的單體及交聯(lián)劑對檸檬酸及雙酚A進行了檢測。用分子印跡聚合物作為識別元件還可以實現(xiàn)多個靶標(biāo)同時檢測，如2017年Saylan等[67]首先將N-甲基丙烯?；?1-苯丙氨酸甲酯單體與氰嗪、西馬嗪、及莠去津進行化學(xué)反應(yīng)，然后再加入單體（1-乙烯基咪唑）、交聯(lián)劑（乙二醇二甲基醚）進行2 h預(yù)聚合，最后加入N,N’-偶氮二異丁腈引發(fā)劑在SPR芯片上進行印跡聚合物的合成，此聚合物可以同時識別這3 種農(nóng)藥，并且經(jīng)檢測得到較低的檢測限，分別為0.095、0.031、0.091 nmol/L。為了增強信號，Shrivastav等[68]將10～30 nm的銀納米顆粒引入印跡膜中，其靈敏度比未添加銀納米顆粒的傳感器提高了2 倍。不同的是Verma等[69]首先在光纖維的表面涂抹一層銀金屬膜，然后在其表層制備四環(huán)素的分子印跡膜，從而得到高選擇性的光纖傳感器。Kara等[70]用微乳液兩相聚合方法制得氯霉素分子印跡膜，通過SPR對其檢測，檢測限低至40 ng/kg。

圖7 分子印跡聚合物制備過程簡易原理圖[58]Fig.7 Schematic diagram of MIP preparation process[58]

圖8 基于MIP的SPR裝置示意圖[64]Fig.8 Schematic diagram of SPR device based on MIP[64]

表3 基于分子印跡聚合物識別元件的SPR傳感器在食品檢測中的應(yīng)用Table3 Application of SPR sensors based on MIP recognition elements in agricultural product detection

1.4 蛋白質(zhì)

凝集素是動植物蛋白質(zhì)或糖蛋白，其可以選擇性地結(jié)合細菌細胞表面主要結(jié)構(gòu)成分的多糖結(jié)構(gòu)，Wang Yixian等[77]用凝集素作為SPR的識別元件對大腸桿菌的進行了檢測，通過自組裝單層將凝集素固定在SPR芯片上，在緩沖溶液中捕獲大腸桿菌O157:H7，原理如圖9所示，并從5 種不同植物中篩選對大腸桿菌選擇性較高的凝集素，成功用于黃瓜和碎牛肉樣品中細菌的檢測。與上述不同的是，Olguín等[78]利用Toll樣受體5可以特異性識別鞭毛蛋白（細菌鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白）的特性來檢測大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌，這項研究證明了蛋白脂質(zhì)體作為識別元件用于快速檢測鞭毛細菌的實際可能性，這可以幫助人類避免食用被污染的食物，從而防止腸道感染。用蛋白質(zhì)作為識別元件還可以來檢測重金屬，如Raz等[79]用金屬硫蛋白來檢測銀離子，取得不錯的結(jié)果。

圖9 用于大腸桿菌O157:H7檢測的凝集素-SPR傳感器原理圖[77]Fig.9 Lectin-SPR sensors for the detection of Escherichia coli O157:H7[77]

圖10 用于檢測SEB的基于肽的SPR傳感器示意圖[81]Fig.10 A peptide-based SPR sensor for the detection of SEB[81]

1.5 肽

肽作為大分子的一類也可以用來作為SPR的識別元件，如Ding Xiaokang等[80]在2012年通過噬菌體展示技術(shù)文庫篩選出兩段寡肽片段，分別與噻蟲啉及吡蟲啉具有親和性，于是將寡肽作為識別分子應(yīng)用到SPR技術(shù)中，對噻蟲啉及吡蟲啉進行檢測，檢測限可分別達到1.2 μmol/L和0.9 μmol/L，雖然檢測靈敏度較低，但是為農(nóng)藥檢測的分子識別選擇提供了新的思路。2014年，Dudak等[81]用從噬菌體展示文庫中得到的24-mer肽來識別檢測葡萄球菌腸毒素B，并成功在牛奶樣品中進行了測試，進一步證明了肽作為SPR識別元件的可能性（圖10）。

1.6 酶

有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥是乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）的抑制劑，此兩類農(nóng)藥可以與AChE上的活性位點絲氨酸殘基形成共價鍵結(jié)合，從而抑制AChE的活性，因此可以將AChE作為SPR傳感器上的識別分子進行農(nóng)藥的檢測，近年來在這方面的研究并不多（表4），可能是由于其較低的專一性所致。Kumar等[82]利用此原理同時檢測了馬拉硫磷及敵百蟲，此研究的特殊之處是引入了納米銀離子并且將其固定在玻璃板上，解決了膠體銀影響納米粒子在水相中聚集及污染水源的問題，而且有效提高了傳感器的檢測靈敏度，達到0.455 nmol/L和5.46 nmol/L。Lin等[83]在檢測對氧磷時也引入了金屬納米粒子來提高靈敏度，達到0.234 ng/mL。

表4 基于乙酰膽堿酯酶識別元件的SPR傳感器在食品檢測中的應(yīng)用Table4 Applications of SPR Sensors based on acetyl cholinesterase recognition elements in agricultural product detection

2 結(jié) 語

SPR傳感器應(yīng)用于食品安全檢測已取得了較好的進展，為了增加其應(yīng)用，還應(yīng)做到以下幾點：1）增加與納米技術(shù)的聯(lián)用，提高對小分子物質(zhì)的檢測靈敏度；2）發(fā)展有效的可再生SPR芯片，降低實驗成本；3）開發(fā)多通道、多組分識別SPR傳感器，如與微流控技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)高通量復(fù)合檢測；4）降低儀器成本，使儀器便攜化、小型化。