張玉晗，謝 晶*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

花鱸（Lateolabrax maculatus）是我國主要的養(yǎng)殖海水魚品種之一。每年10～11月份養(yǎng)殖鱸魚開始大量上市，其中以鮮活花鱸價(jià)格最高、市場行情最好[1]；因此有必要實(shí)現(xiàn)花鱸由養(yǎng)殖基地到銷售市場的保活運(yùn)輸。采用生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)法運(yùn)輸花鱸的研究目前鮮見報(bào)道，如能成功運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)則可以顯著降低花鱸運(yùn)輸成本，并加大運(yùn)輸量、擴(kuò)大活魚銷售范圍[2]。

生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)法運(yùn)輸活魚的過程中，人工操作（捕撈、降溫、包裝、搬運(yùn)、運(yùn)輸）會(huì)導(dǎo)致魚產(chǎn)生一系列應(yīng)激行為，造成魚生理指標(biāo)變化，甚至魚體體表及組織產(chǎn)生損傷[3-4]。溫度可對魚類代謝反應(yīng)起控制作用，從而影響魚體生理生化變化[5]。肝組織是魚體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的主要器官，表現(xiàn)為肝細(xì)胞凋亡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞質(zhì)外流等[6]。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體在一定的自身或外界條件刺激下，細(xì)胞為維護(hù)機(jī)體而結(jié)束自身活性的過程。細(xì)胞凋亡受到半胱氨酸蛋白酶家族嚴(yán)格調(diào)控；因此，檢測細(xì)胞凋亡酶活性變化可反映魚體組織的受損傷程度[6-11]。在正常情況下，半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序被觸發(fā)后酶活性明顯升高，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)；其中，Caspase-3最后被激活，它是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[8]。魚前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素-9（protein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK-9）是層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一員，參與細(xì)胞凋亡，同時(shí)，還可影響魚體細(xì)胞周期、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)等[10]。采用生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)活魚必須經(jīng)歷從常溫開始的降溫過程，而降溫速率是影響活魚無水?；钸\(yùn)輸成活率的關(guān)鍵因素；鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過對花鱸肝組織Caspase-3活力、丙二醛（malonaldehyde，MDA）濃度、血清中PCSK-9、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力變化研究，探討無水運(yùn)輸過程中不同降溫速率對花鱸肝組織造成的影響，為其保活運(yùn)輸工藝的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花鱸購自上海當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場。挑選體質(zhì)健康、無外傷、鱗片完整、大小基本一致（長約40 cm）的活花鱸作為實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)用水由經(jīng)顆粒活性炭過濾后曝氣的自來水和海鹽配制而成，實(shí)驗(yàn)開始前1 d配制，連續(xù)曝氣24 h后用于實(shí)驗(yàn)。水溫22～23 ℃、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%～1.7%、溶解氧質(zhì)量濃度4～6 mg/L、pH 7.5～8.5[10]。

Caspase-3活力檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、PCSK-9酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒及AST、ALT檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)循環(huán)冷水機(jī) 廣東海利集團(tuán)；LX-100VTR模擬運(yùn)輸振動(dòng)臺(tái) 上海魯軒儀器設(shè)備廠；SH-1000Lab-全波長酶標(biāo)儀 北京宏昌信科技有限公司；F2640型多點(diǎn)溫度采集儀 美國Fluke公司；5810R高速冷凍離心機(jī)上海艾測電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

在養(yǎng)殖池（密度：20 尾/m3）中進(jìn)行周期饑餓馴化[12]，喂食1 d饑餓3 d（持續(xù)2 個(gè)周期），早晚各喂食1 次，投喂魚體質(zhì)量10%的飼料[13]，并接受日常光照；第3周期饑餓開始的第1天將花鱸食物誘捕（單條捕撈）進(jìn)暫養(yǎng)箱（密度：1 尾/50 L），禁食暫養(yǎng)6 h[14-15]；再對魚進(jìn)行冷馴化（冷水機(jī)分別按照1、3、5 ℃/h降溫速率將暫養(yǎng)箱中水溫從22～23 ℃降至臨界溫度4 ℃）對魚進(jìn)行冷馴化[16-18]（此時(shí)魚體呼吸頻率（24±3）次/min，魚體表現(xiàn)為失去平衡、魚腹朝上、裂鰓、應(yīng)激反應(yīng)遲鈍、呼吸極不規(guī)律）。在冷馴化過程中，隨著水溫降低，魚呼吸速率明顯減慢，在觸及反應(yīng)十分微弱后撈出，放于泡沫箱（23 cm×45 cm×13 cm）內(nèi)的濕木屑上（4 ℃、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%～1.7%的水潤濕1 h后瀝干），然后裝入塑料袋內(nèi)（1 箱/袋），將塑料袋內(nèi)空氣排出，放入CO2吸收藥包、冰袋（不與魚接觸）后充入氧氣，扎緊袋口后，放入振動(dòng)臺(tái)上大保溫箱內(nèi)[19-20]。

1.3.2 模擬汽車中長途公路運(yùn)輸

振動(dòng)臺(tái)上進(jìn)行室內(nèi)模擬運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)；運(yùn)輸過程：B級(jí)路面（80 km/h）1 h→A級(jí)路面（100 km/h）5 h→B級(jí)路面（80 km/h）2 h；運(yùn)輸總時(shí)間8 h（運(yùn)輸時(shí)間由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）；總路程740 km[21]。模擬運(yùn)輸8 h結(jié)束后，打開包裝，取出魚，放入22～23 ℃養(yǎng)殖水溫中直接喚醒。

本實(shí)驗(yàn)是通過物理降溫的方式誘導(dǎo)花鱸休眠，以達(dá)到無水保活的目的。實(shí)驗(yàn)共分為3組，每組樣品30 條?；|生理指標(biāo)檢測時(shí)間點(diǎn)為：運(yùn)輸開始0 h、運(yùn)輸1 h、運(yùn)輸2 h、運(yùn)輸8 h、8 h喚醒后；每個(gè)測試點(diǎn)隨機(jī)選取3 尾魚進(jìn)行指標(biāo)測試；以養(yǎng)殖池中饑餓馴化過，未經(jīng)降溫、運(yùn)輸操作的花鱸為對照組（CK組）；每組剩余10 尾用于記錄花鱸運(yùn)輸后各降溫速率處理組的喚醒時(shí)間，以及喚醒后8 h和1、2 d時(shí)的死亡率。

1.3.3 指標(biāo)測定

花鱸經(jīng)木棒敲擊致死，稱質(zhì)量和量體長后，采用1 mL一次性醫(yī)用注射器（預(yù)先用10 mg/mL肝素鈉溶液潤洗）尾部靜脈取血，采取的血樣在4 ℃冰箱放置2 h后，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，上清液即為制備的血清；取血后的魚置于冰盤上，解剖出魚肝臟，血清和肝臟均迅速存放于-80 ℃冰箱。

1.3.3.1 肝組織中Caspase-3活力、MDA濃度的測定

分別采用Caspase-3活力檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒測定肝組織勻漿中的Caspase-3活力/（U/L）和MDA濃度/（nmol/L）。

1.3.3.2 血清中PCSK-9、AST、ALT活力的測定

采用PCSK-9酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒和AST、ALT檢測試劑盒分別測定血清中PCSK-9、AST、ALT活力，單位為U/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示，Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中肝組織Caspase-3活力的影響

細(xì)胞凋亡檢測是組織發(fā)生損傷時(shí)的常規(guī)檢測。Caspase-3在細(xì)胞受到刺激、損傷或接到死亡信號(hào)指令等信號(hào)時(shí)被激活，活化的Caspase-3可通過水解特異性蛋白底物從多方面促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[22-25]。CK組Caspase-3活力為（1.44±0.17）U/L。如圖1所示，與CK組相比，各降溫速率處理組在運(yùn)輸0 h時(shí)，肝組織中Caspase-3活力明顯升高（P＜0.05），且不同降溫速率處理組之間差異明顯。隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長，3 個(gè)不同降溫速率組的Caspase-3活力不斷增強(qiáng)，運(yùn)輸結(jié)束后Caspase-3活力呈下降趨勢，說明運(yùn)輸8 h喚醒后花鱸肝組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減弱。降溫結(jié)束后（運(yùn)輸0 h），1 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力顯著高于3、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這是可能是由于降溫處理時(shí)間過長，環(huán)境刺激肝組織細(xì)胞，導(dǎo)致Caspase-3活力強(qiáng)。3 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這可能是由于3 ℃/h降溫速率有效地降低了魚體的氧化應(yīng)激，因氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，Caspase-3活力降低。徐瑾等[26]研究發(fā)現(xiàn)，超低溫保存中的氧化應(yīng)激不僅可以直接造成細(xì)胞損傷，也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力低于1 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），可能是由于該組降溫速率快，處理時(shí)間短，低溫抑制了Caspase-3活力。由此可知降溫速率慢會(huì)導(dǎo)致Caspase-3活力升高，從而引起肝組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中肝組織Caspase-3活力的影響Fig.1 Effect of cooling rate on caspase-3 activity in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

2.2 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中肝組織MDA濃度的影響

圖2 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中肝組織MDA濃度的影響Fig.2 Effect of cooling rate on MDA concentration in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

在運(yùn)輸環(huán)境下，魚類會(huì)產(chǎn)生過量的氧自由基，引起脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子過氧化，其中脂質(zhì)過氧化對機(jī)體的損傷最大，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA等物質(zhì)會(huì)破壞生物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。肝臟是魚體抗氧化反應(yīng)的主要器官，肝組織氧自由基生成增多是誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的重要原因。有研究表明，肝組織內(nèi)MDA含量與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量有顯著的正相關(guān)關(guān)系[27]。CK組MDA濃度為（8.38±0.73）nmol/L。如圖2所示，降溫結(jié)束后，3 個(gè)不同降溫速率組的MDA濃度增加，且隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長，MDA濃度不斷增加，運(yùn)輸結(jié)束后，喚醒過程使MDA濃度下降（P＜0.05）。運(yùn)輸過程中3 ℃/h降溫處理組肝組織內(nèi)MDA濃度顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這表明3 ℃/h降溫有效降低了魚體的氧化應(yīng)激。不同降溫速率導(dǎo)致無水活運(yùn)過程中花鱸肝組織產(chǎn)生劇烈脂質(zhì)過氧化，造成肝組織細(xì)胞大量凋亡與損傷，這可能也是花鱸無法長時(shí)間活運(yùn)的主要原因。與運(yùn)輸8 h比較，喚醒后花鱸的肝組織內(nèi)MDA濃度呈下降趨勢，但依然很高，表明無水活運(yùn)過程對花鱸肝臟的損傷是不可逆的。

2.3 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中血清PCSK-9活力的影響

圖3 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中血清PCSK-9活力的影響Fig.3 Effect of cooling rate on serum PCSK-9 activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

PCSK-9可進(jìn)入體循環(huán)影響血脂水平，還可參與細(xì)胞的凋亡[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)PCSK-9被激活后，細(xì)胞凋亡率也有所升高，其機(jī)制可能是通過切割Caspase-3前體，從而激活Caspase-3的活力，發(fā)揮促使細(xì)胞凋亡的作用[30-34]。CK組PCSK-9活力為（0.095±0.570）U/L。如圖3所示，運(yùn)輸0 h時(shí)，3 個(gè)降溫速率處理組花鱸肝組織Caspase-3活力較CK組均增高，且5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力顯著低于1、3 ℃/h降溫處理組（P＜0.05）；這可能是由于降溫速率快，溫差大抑制了花鱸血清中PCSK-9活力。運(yùn)輸2 h，3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），5 ℃/h降溫處理組呈現(xiàn)驟然增高的值，同時(shí)偏差較大，不排除取樣時(shí)魚體樣本自身原因；PCSK-9參與了花鱸的細(xì)胞凋亡，這個(gè)過程中通過消耗PCSK-9激活Caspase-3的活力，故而血清中PCSK-9活力在運(yùn)輸過程中呈現(xiàn)較低水平。運(yùn)輸8 h后，喚醒階段3、5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力明顯增高，這可能是由于運(yùn)輸結(jié)束后使用常溫養(yǎng)殖水直接喚醒，再次誘發(fā)了魚體產(chǎn)生應(yīng)激。

2.4 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中血清AST、ALT活力的影響

圖4 降溫速率對花鱸無水活運(yùn)過程中血清AST（A）、ALT（B）活力的影響Fig.4 Effect of cooling rate on serum AST (A) and ALT (B) activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

正常情況下花鱸血清中AST、ALT活力很低而且含量相對穩(wěn)定，但當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)血清中AST、ALT活力會(huì)升高，故血清中AST、ALT活力可以反映肝細(xì)胞損傷和代謝程度，被用來作為確認(rèn)肝功能是否損傷的最具特異性并廣泛使用的指標(biāo)[35]。CK組AST、ALT活力分別為（92.19±3.23）、（53.29±2.46）U/L。如圖4A、B所示，運(yùn)輸0 h時(shí)，1、3、5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力明顯高于CK組，表明降溫會(huì)對魚體的肝臟造成損傷。何蓉等[36]研究不同溫度無水活運(yùn)中華鱉，發(fā)現(xiàn)低溫造成AST活力升高，且隨運(yùn)輸時(shí)間延長，AST活力有所下降，與本研究結(jié)果相一致。3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力明顯低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），表明3 ℃/h降溫時(shí)，因降溫處理時(shí)間短、溫差小能夠適當(dāng)緩解花鱸因?yàn)檫\(yùn)輸操作造成的肝臟損傷。運(yùn)輸8 h的過程中，3 組花鱸血清中AST、ALT活力均呈升高趨勢，其中運(yùn)輸8 h和喚醒處理后，1 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力均顯著低于5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），且5 ℃/h降溫處理組ALT活力升高速度快（P＜0.05），表明降溫速率快會(huì)導(dǎo)致魚體肝臟組織受損加重。運(yùn)輸8 h后，喚醒過程中3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST活力較運(yùn)輸過程中的增長減緩（P＜0.05），5 ℃/h降溫速率處理組ALT活力降低，1 ℃/h降溫速率處理組AST、ALT活力仍較高。這可能是由于長時(shí)間低溫?zé)o水環(huán)境，機(jī)體代謝逐漸以無氧呼吸為主，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)問題，導(dǎo)致“喚醒”后的花鱸肝臟恢復(fù)緩慢或已產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷。

2.5 不同降溫速率對花鱸無水活運(yùn)后死亡率的影響

將生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)法運(yùn)輸后的花鱸直接放入常溫（22～23 ℃）水中，可以觀察到魚尾擺動(dòng)幅度越來越大，魚鰓開始不規(guī)律地開閉，呼吸頻率越來越大，逐漸接近正常水平，過程大約需20 min左右（1、3、5 ℃/h降溫處理并無水活運(yùn)后花鱸喚醒時(shí)間分別為19、1 min和16 min）（表1），魚體恢復(fù)正常的游動(dòng)。

表1 喚醒后時(shí)間對不同降溫速率處理組無水活運(yùn)花鱸死亡率的影響Table1 Mortality rate of Lateolabrax maculatus with precooling treatment at different cooling rates%

各組花鱸在常溫水中喚醒8 h后均出現(xiàn)死魚現(xiàn)象，如表1所示，1 ℃/h降溫處理組花鱸在運(yùn)輸后1 d死亡率就高達(dá)50%，2 d死亡率達(dá)到70%；隨著喚醒后時(shí)間的延長，1 ℃/h降溫處理組花鱸死亡率不斷升高，3 ℃/h降溫處理組花鱸死亡率在3 個(gè)降溫處理組中最低，但與業(yè)界期望值還有差距。這可能是本實(shí)驗(yàn)操作“喚醒”步驟時(shí)采用了常溫快速喚醒，花鱸已經(jīng)過降溫、包裝、運(yùn)輸過程中的應(yīng)激，體內(nèi)能量已不足，免疫系統(tǒng)紊亂，適應(yīng)環(huán)境能力差，將此時(shí)的花鱸放入與之前運(yùn)輸箱內(nèi)環(huán)境差異較大的地方，導(dǎo)致花鱸再次應(yīng)激，因而死亡率高。

3 結(jié) 論

花鱸可以通過低溫誘導(dǎo)休眠的方式進(jìn)行無水?；?，無水活運(yùn)8 h，常溫喚醒后魚體可回到正常狀態(tài)并存活一段時(shí)間，這項(xiàng)技術(shù)可用于花鱸一定距離的無水活運(yùn)。運(yùn)輸0 h，1、3、5 ℃/h 3個(gè)降溫速率處理組的花鱸肝組織Caspase-3活力、MDA濃度及血清中PCSK-9、AST、ALT活力指標(biāo)數(shù)值較CK組均增高，運(yùn)輸結(jié)束后，喚醒過程使Caspase-3活力和MDA濃度下降，PCSK-9活力增高，ALT活力增加減緩或降低。1 ℃/h降溫處理組花鱸喚醒時(shí)間長，喚醒后2 d死亡率達(dá)到70%，不利于實(shí)現(xiàn)?；钸\(yùn)輸價(jià)值。3 ℃/h降溫處理組肝組織中Caspase-3活力、MDA濃度和血清中ALT、AST活力、養(yǎng)殖水喚醒后死亡率顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），且顯著高于CK組（P＜0.05）；因此3 ℃/h降溫處理后無水活運(yùn)對花鱸肝組織損害低。

建議將花鱸通過低溫誘導(dǎo)休眠的方式進(jìn)行無水?；畹慕禍厮俾试O(shè)定為3 ℃/h，同時(shí)建議今后可在暫養(yǎng)密度、包裝條件尤其是“喚醒”工藝等參數(shù)優(yōu)化方面開展進(jìn)一步深入研究，提高運(yùn)輸后的存活率。目前研發(fā)的生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)法可用于中短途花鱸的?；钸\(yùn)輸。