趙城彬，齊寶坤，張 浩，劉景圣，許秀穎，曹 勇，吳玉柱，吳 非,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）可作為一種食品添加劑應用于食品體系中，不僅具有高營養(yǎng)價值，還具有乳化性、凝膠性、起泡性等多種功能特性，對食品品質(zhì)的改善具有重要作用[1]。這些功能特性均受蛋白質(zhì)溶解性的影響，良好的溶解性是大豆蛋白發(fā)揮其他功能特性的基礎[2]。近年來，蛋白質(zhì)糖基化改性受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。蛋白質(zhì)與糖之間可以通過共價鍵結合形成穩(wěn)定的共價復合物，共價鍵一般由糖的還原羧基與蛋白質(zhì)的活性氨基通過化學反應形成，最終能夠得到一種酰胺化合物[3]。Wang Xibo等[4]將SPI與乳糖進行糖基化反應，發(fā)現(xiàn)其功能性質(zhì)尤其是溶解性得到明顯改善。然而，采用傳統(tǒng)方法進行糖基化反應時間長、效率低，同時產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。超聲波技術作為一種改性方法廣泛應用于食品蛋白加工中，超聲波直接作用于食品蛋白，能夠修飾蛋白質(zhì)分子結構，改善蛋白質(zhì)功能特性。另外，超聲波也可作為預處理手段或輔助手段促進蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的化學反應，達到改性目的[5]。Jiang Lianzhou等[6]采用頻率為20 kHz、功率為150 W的超聲探頭對黑豆蛋白溶液處理12 min，發(fā)現(xiàn)黑豆蛋白分子的空間結構發(fā)生改變，溶解性得到改善。Li Chen等[7]采用超聲法和濕熱法對花生分離蛋白與葡甘露聚糖進行糖基化反應制備共價復合物，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠加快蛋白質(zhì)與多糖之間的接枝反應速率，超聲法制備的復合物具有更少的α-螺旋結構、更多的β-結構和無規(guī)卷曲、較高的表面疏水性和更松散三級結構，且溶解性和乳化性均得到改善。然而，關于超聲預處理制備SPI/糖復合物的分子結構與溶解性的構效關系及促溶機制的報道較少。本實驗對濕熱法制備的SPI/糖復合物進行超聲預處理，采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopic，F(xiàn)TIR）和熒光光譜技術對糖基化復合物的分子結構進行分析，同時測定其溶解度，探討超聲預處理對SPI/糖復合物結構和溶解性的影響，為改善大豆蛋白溶解性以及進一步了解超聲作用下SPI/糖復合物的促溶機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI 哈高科食品有限責任公司；葡萄糖（glucose，G）、麥芽糖（maltose，M）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇 美國Sigma公司；溴化鉀 上?；瘜W試劑公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；JY92-2D超聲探頭發(fā)生器 寧波Scientz生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；LGJ-1冷凍干燥機 上海醫(yī)用離心機廠；DU800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；TNZ1-5700 FTIR儀 美國Thermo Fisher公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI糖基化復合物的制備

將SPI分散到0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，配制質(zhì)量分數(shù)為8%的SPI溶液。以SPI/糖質(zhì)量比1∶1分別向SPI溶液中添加葡萄糖和麥芽糖混合均勻，配成SPI/糖混合液。將混合液在室溫下磁力攪拌2 h，4 ℃貯藏過夜，以確保SPI完全溶解并充分與糖混勻。控制超聲功率為200 W，室溫下分別對混合液超聲預處理5、10、20、30 min。超聲處理模式為開啟3 s、關閉1 s。超聲預處理后將混合液置于95 ℃水浴中熱處理15 min，迅速冷卻后冷凍干燥即得超聲SPI/G復合物和超聲SPI/M復合物，分別記作U-SPI/G和U-SPI/M。相同的混合液未經(jīng)超聲預處理直接進行95 ℃水浴熱處理，隨后的處理與超聲SPI/糖復合物相同，得到非超聲SPI/G復合物和非超聲SPI/M復合物，分別記作NU-SPI/G和NU-SPI/M。

以不添加糖的SPI樣品為對照。SPI在相同的條件下經(jīng)超聲預處理后，95 ℃水浴加熱15 min的樣品為超聲SPI，記作U-SPI；SPI在相同的條件下未經(jīng)超聲預處理，直接進行95 ℃水浴加熱15 min的樣品為非超聲SPI，記作NU-SPI；未經(jīng)任何處理的SPI為天然SPI。

1.3.2 DG測定

采用OPA試劑法測定接枝度（degree of graft，DG）。將80 mg OPA溶解在2 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液中，并與50 mL 10 mmol/L四硼酸鈉緩沖液（pH 9.7）、5 mL質(zhì)量分數(shù)20% SDS溶液以及200 μL β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水稀釋至100 mL，配成OPA試劑。將200 μL復合體系樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL OPA試劑在室溫下反應5 min，然后采用紫外-可見分光光度計測定340 nm波長處的吸光度，以天然SPI作為對照樣品，DG的計算公式如下。

式中：Ac為對照樣品的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.3 褐變強度測定

根據(jù)Abdelhedi等[8]的方法測定褐變強度。將待測樣品采用去離子水稀釋至質(zhì)量分數(shù)1%，空白樣品為去離子水。采用紫外-可見分光光度計測定420 nm波長處的吸光度A420nm以表示褐變強度。

1.3.4 FTIR測定

參照趙城彬等[9]的方法測定FTIR圖譜，將蛋白樣品與溴化鉀研磨成均勻粉末，壓片后置于FTIR儀中測定。FTIR儀的測定溫度為25 ℃，波數(shù)掃描范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。采用Peak Fit 4.12 FTIR圖譜分析軟件對樣品的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）進行分析，計算蛋白質(zhì)各二級結構含量。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測定

蛋白樣品的內(nèi)源熒光光譜根據(jù)Zhao Chengbin等[10]的方法測定。采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制1.5 mg/mL蛋白溶液，在激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長為300～450 nm，狹縫寬度為5 nm的條件下，通過F2000熒光光譜儀測定樣品的內(nèi)源熒光光譜。

1.3.6 溶解度測定

將樣品溶于去離子水中，配成蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。采用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2、3、4、4.5、5、6、7、8、9，在12 000×g下離心30 min。以BSA為標準物，采用Lowry法測定上清液中可溶性蛋白含量。蛋白質(zhì)溶解度以上清液可溶性蛋白含量占總蛋白含量的比例表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗重復3 次，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲預處理時間的確定

圖1 SPI與葡萄糖和麥芽糖糖基化復合物DG隨超聲時間的變化Fig.1 The changes in the degree of graft for glycoconjugates of SPI with glucose and maltose as ultrasound time

如圖1所示，無論是否進行超聲預處理，在相同處理條件下，SPI/G復合物的DG均顯著高于SPI/M復合物（P＜0.05），這表明SPI更容易與葡萄糖發(fā)生反應。根據(jù)Chevalier等[11]的報道，糖基化反應速率與參加反應的還原糖分子質(zhì)量大小有關，單糖比雙糖具有更高的反應活性，這也是SPI/G復合物的DG高于SPI/M復合物的原因。超聲預處理制備的SPI/糖復合物DG比未經(jīng)超聲預處理制備的SPI/糖復合物高，這表明超聲處理后的糖基化反應速率比未經(jīng)超聲處理更快。原因很可能是由于超聲處理過程中蛋白質(zhì)肽鏈展開，利于反應基團的相互靠近[12]，從而促進蛋白質(zhì)與糖之間的糖基化反應。此外，超聲預處理20 min時DG達到最大，而超過20 min后DG稍有降低，這可能是由于過長的超聲處理時間會使蛋白質(zhì)展開的肽鏈重新聚集，不利于糖基化反應的進行[13]。因此，采用超聲預處理時間為20 min進行后續(xù)實驗。

2.2 SPI糖基化復合物褐變強度分析

圖2 非超聲和超聲預處理下SPI和SPI/糖復合物的褐變強度Fig.2 Browning intensity of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

褐變強度能夠表征糖基化反應的高級階段，是糖基化反應進程的指示器[14]。如圖2所示，與天然SPI相比，對SPI進行熱處理不會導致A420nm的增加。然而，SPI/糖復合物的A420nm明顯增加。SPI與糖（葡萄糖和麥芽糖）加熱后，由于發(fā)色團的形成[15]，出現(xiàn)了褐變，這表明SPI與糖發(fā)生了糖基化反應。與SPI/G復合物相比，SPI/M復合物的褐變強度顯著增加（P＜0.05）。這很可能是由于糖基化反應過程中雙糖形成的酸比單糖多，導致體系pH值下降，從而加快糖基化反應進程，這與Li Yue等[16]對大米蛋白糖基化反應的研究結果相似。此外，Wang Heya等[17]的研究表明，褐色產(chǎn)物（類黑精）是通過中間產(chǎn)物聚合形成的。超聲預處理能夠降低SPI/糖復合物的A420nm，這可能是由于超聲預處理通過抑制糖基化反應中間產(chǎn)物的聚合而阻礙褐色產(chǎn)物的形成。盡管超聲SPI/糖復合物具有較高的DG（圖1），但是超聲預處理還是會降低SPI/糖復合物的褐變強度，這一結果表明超聲預處理能夠制備高DG且低褐變的SPI/糖復合物。

2.3 SPI糖基化復合物FTIR分析

圖3 非超聲和超聲預處理下SPI（A）和SPI/糖復合物（B）的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of SPI (A) and SPI-sugar conjugates (B) with and without ultrasonic pretreatment

FTIR技術作為大分子物質(zhì)分析的有效手段，通過分子內(nèi)原子振動產(chǎn)生的能量吸收，廣泛應用于食物的組分、大分子聚合物的化學組成以及蛋白質(zhì)的二級結構分析等方面[18]。由圖3A可以看出，無論是否進行超聲預處理，在不添加糖的情況下，熱處理SPI的FTIR吸收峰的變化趨勢及峰形與天然SPI相似。熱處理能夠使SPI在1 658 cm-1（酰胺I帶）和1 542 cm-1（酰胺II帶）處的吸收峰強度明顯增加，這分別是由蛋白質(zhì)肽鏈中C＝O伸縮振動和N—H彎曲振動產(chǎn)生的[19]。

由圖3B可以看出，糖基化作用使SPI的FTIR圖譜發(fā)生顯著改變。與天然SPI相比，SPI/糖復合物在3 314 cm-1處出現(xiàn)一個寬峰且吸收強度增大，這是由于游離—OH的伸縮振動產(chǎn)生的[20]。這表明SPI發(fā)生糖基化反應后，糖分子以共價鍵形式接入SPI中，使—OH的數(shù)量增多。與SPI/G復合物相比，SPI/M復合物在3 314 cm-1處具有更強的吸收峰，這可能是由于麥芽糖由兩個葡萄糖分子構成，具有更多的—OH，導致此處吸收峰更強。在1 077 cm-1處，天然SPI幾乎沒有吸收峰，而SPI/糖復合物具有很強的吸收峰，這是由糖分子中C—O—C糖苷鍵的伸縮振動產(chǎn)生的[21]，表明糖分子與SPI發(fā)生了糖基化反應，引入了相應的功能性基團，導致蛋白分子側鏈振動，并產(chǎn)生了相應的吸收峰。SPI/M復合物在1 077 cm-1處的吸收峰比SPI/G復合物強，這是由于麥芽糖比葡萄糖具有更多能夠在此處產(chǎn)生吸收峰的基團。與天然SPI相比，在1 658 cm-1（酰胺I帶）、1 542 cm-1（酰胺II帶）和1 405 cm-1（酰胺III帶）處，SPI/糖復合物的吸收峰增強，SPI/M復合物具有比SPI/G復合物更強的吸收峰。Gu Fenglin等[22]在對酪蛋白與葡萄糖美拉德反應的研究中發(fā)現(xiàn)，美拉德產(chǎn)物（如糖胺化合物、席夫堿和吡嗪類化合物）含量升高會使酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶處的吸收峰增強。酰胺I～III帶處的吸收峰強度的變化表明糖基化反應的發(fā)生。此外，SPI/糖復合物在2 931 cm-1處的吸收變強，這是由糖分子中—CH3和—CH2基團中C—H的伸縮振動產(chǎn)生的[23]，進一步證實了糖分子與SPI形成了共價復合物。超聲預處理不會改變SPI/糖復合物FTIR的吸收峰。以上分析可以得出，SPI與糖分子之間發(fā)生了復雜的交聯(lián)和聚合作用，形成了SPI/糖復合物。

利用波段縮小技術將蛋白質(zhì)FTIR酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）細分，采用二階導數(shù)紅外去卷積光譜擬合法對二級結構進行定量分析。確定擬合圖譜中各子峰與二級結構類型的對應關系：1 610～1 640 cm-1為β-折疊結構；1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲結構；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結構；1 660～1 700 cm-1為β-轉角結構[24]。通過計算各二級結構的峰面積與酰胺I帶總峰面積之比，得到α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲含量，結果見表1。

表1 非超聲和超聲預處理下SPI和SPI/糖復合物的二級結構含量Table1 Secondary structure content of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

由表1可以看出，天然SPI的二級結構α-螺旋和無規(guī)卷曲含量相對較少，主要以β-結構為主。對SPI進行熱處理后，α-螺旋和β-折疊含量顯著降低（P＜0.05），而無規(guī)卷曲含量顯著增加（P＜0.05），這表明熱處理會使SPI分子結構由有序變?yōu)闊o序，可能是由于蛋白分子發(fā)生熱變性使其結構展開，破壞了原來的有序結構，導致無序結構含量增加[25]。此外，超聲預處理會使熱處理過程中蛋白分子結構變得更加無序，結構展開的更加充分，暴露出更多的活性基團，改善了蛋白分子的柔韌性[26]，這也可能是超聲能夠促進糖基化反應的原因。與熱處理SPI相比，SPI/糖復合物α-螺旋含量的增加和無規(guī)卷曲含量的降低說明糖基化反應會減少熱處理過程中SPI二級結構由有序向無序的轉變程度，這可能是由于SPI與糖共價復合抑制了蛋白質(zhì)熱變性而導致的[27]。SPI/G復合物結構比SPI/M復合物更加有序，說明葡萄糖比麥芽糖具有更強的抑制蛋白質(zhì)熱變性作用，這可能與兩種糖DG的不同有關（圖1）。此外，盡管超聲預處理會使熱處理蛋白的二級結構變的更加無序，但超聲作用對于SPI/糖復合物二級結構的影響并不顯著（P＞0.05）。Li Chen等[28]發(fā)現(xiàn)在80 ℃超聲處理下，花生分離蛋白與葡聚糖發(fā)生糖基化反應后生成的復合物二級結構發(fā)生顯著改變，與本研究結果有所不同，這可能是由于大分子多糖和小分子糖的結構和性質(zhì)不同而導致的。

2.4 SPI糖基化復合物內(nèi)源熒光光譜分析

圖4 非超聲和超聲預處理下SPI（A）和SPI/糖復合物（B）的內(nèi)源熒光光譜Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of SPI (A) and SPI-sugar conjugates (B) with and without ultrasonic pretreatment

內(nèi)源熒光光譜用于評價蛋白質(zhì)色氨酸（Trp）殘基周圍的構象變化，表征蛋白質(zhì)三級結構[29]。由圖4A可知，與天然SPI相比，無論是否采用超聲預處理，熱處理均能夠增加SPI的熒光強度，這可能是由于熱處理過程中蛋白質(zhì)變性引起Trp殘基周圍結構改變導致的[30]。超聲SPI的熒光強度高于非超聲SPI，這表明超聲預處理能夠促進蛋白質(zhì)熱變性，導致其結構進一步改變。此外，非超聲SPI和超聲SPI的熒光發(fā)射最大波長（λmax）均比天然SPI高，表明λmax發(fā)生了紅移。與非超聲SPI相比，超聲SPI的λmax紅移程度更大，這表明超聲預處理能夠促進SPI的構象變化。

由圖4B可知，SPI/糖復合物的熒光強度相比于天然SPI明顯增加。Jing Hao等[31]對酪蛋白-糖美拉德產(chǎn)物理化性質(zhì)的研究表明，熒光復合物的增加可能與熱誘導糖基化反應有關。超聲預處理能夠使SPI/糖復合物的熒光強度進一步增加，這表明超聲作用促進了熒光復合物的生成。與SPI/M復合物相比，SPI/G復合物具有更高的熒光強度，這與不同糖復合物的光譜學性質(zhì)和熒光化學結構有關[32]，該結果與β-乳球蛋白糖基化復合物的研究結果相似[33]。此外，所有SPI/糖復合物的λmax均發(fā)生紅移。SPI/糖復合物λmax的紅移表明糖基化會改變SPI的構象，同時使SPI三級結構變得松散。與非超聲SPI/糖復合物相比，超聲預處理制備的SPI/糖復合物具有更松散的三級結構，這與Perusko等[34]對乳清蛋白/阿拉伯糖復合物的研究結果相似。

2.5 SPI糖基化復合物溶解性分析

圖5 非超聲和超聲預處理下SPI和SPI/糖復合物溶解度隨pH值的變化Fig.5 Changes in solubility of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment as a function of pH

如圖5所示，天然SPI在pH 4.5時的溶解度最低，這說明SPI的等電點在pH 4.5附近。對SPI進行熱處理會降低蛋白質(zhì)等電點附近的溶解性，但會增加遠離蛋白質(zhì)等電點處的溶解性。在對SPI加熱前進行超聲預處理會明顯增加SPI溶解性，這可能是由于超聲作用改變了SPI結構，使蛋白分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露出來，增加了蛋白質(zhì)表面電荷，通過靜電排斥作用降低了蛋白質(zhì)的聚集，從而改善其溶解性[35]。當SPI與葡萄糖或麥芽糖發(fā)生糖基化反應后溶解度顯著增加（P＜0.05），尤其是在等電點附近。這是由于糖分子中親水性羥基的引入增加了蛋白質(zhì)與水分子之間的親和力，同時降低由蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用引起的聚集，導致蛋白質(zhì)溶解性增加[36]。SPI/M復合物比SPI/G復合物溶解性高，這是由于麥芽糖分子具有更多的親水性羥基。超聲預處理會明顯增加SPI/糖復合物的溶解性，這可能與超聲預處理提高SPI/糖復合物的DG有關（圖1）。Qu Wenjuan等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲作用能夠提高菜籽分離蛋白-葡聚糖復合物的DG，導致其溶解性得到改善，與本研究結果一致。此外，雖然超聲作用對SPI/糖復合物二級結構的影響并不顯著（表1），但能使復合物三級結構變得更加松散（圖4），這可能是改善蛋白質(zhì)溶解性的主要原因。無論是否進行超聲預處理，SPI/糖復合物的等電點都會向酸性方向偏移，這可能是由于糖基化反應會消耗帶正電的游離氨基，從而減少蛋白質(zhì)表面的正電荷[38]。

3 結 論

將SPI分別與葡萄糖和麥芽糖發(fā)生糖基化反應。DG與褐變強度的分析表明，與麥芽糖相比，SPI更容易與葡萄糖發(fā)生反應，超聲預處理20 min時，SPI/糖復合物的DG最大，且超聲預處理制備的SPI/糖復合物具有較低的褐變強度。FTIR分析表明SPI與糖分子形成了SPI/糖復合物。對酰胺I帶擬合后得到蛋白質(zhì)各二級結構含量，糖基化反應會減少熱處理過程中SPI二級結構由有序向無序的轉變程度，超聲預處理對SPI/糖復合物二級結構的影響并不顯著。內(nèi)源熒光光譜分析表明糖基化作用會使SPI的λmax發(fā)生紅移，導致蛋白質(zhì)三級結構變得松散，超聲預處理能夠增加SPI/糖復合物λmax的紅移程度。溶解性分析表明糖基化反應能夠提高SPI溶解性，尤其是在等電點附近。超聲預處理會增加SPI/糖復合物的溶解性，這可能與較高的DG有關。此外，超聲預處理使SPI/糖復合物三級結構變得松散也可能是其改善蛋白質(zhì)溶解性的原因。