趙金龍，李延紅，孫漢巨，方 利，孫先保，唐明明，張 揚，武香玉，何述棟,*

（1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.常州天地人和生物科技有限公司，江蘇 常州 213000；3.河南省農業(yè)科學院經濟作物研究所，河南 鄭州 450002；4.山東省肥城市食品藥品監(jiān)督管理局，山東 肥城 271608）

凝集素是一類非免疫來源的、不具有酶催化活性的糖蛋白或糖結合蛋白，在一些豆科植物種子或豆科食物中含量較高[1-2]，是一種公認的抗營養(yǎng)因子，可誘發(fā)病理性惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀[3-4]。然而，凝集素在生物和醫(yī)藥領域具有重要的應用，如血型鑒定、抗病毒、抑制惡性癌細胞、免疫應答和藥物靶向定位等[5]。目前，高純度的凝集素蛋白樣品需經過多步色譜純化或者單步多次重復純化獲得。但是，隨著色譜純化步驟的增加，凝集素蛋白的得率及活性將顯著降低[6-7]。因此，快速、經濟、高效地分離純化豆類凝集素，將顯著提高豆類作物的經濟利用價值。

親和色譜是一種利用生物分子之間特異識別的原理（如酶與底物、抗體與抗原、凝集素與特異性結合的糖等）對生物大分子進行分離純化的方法[8-9]。親和色譜主要由固相載體及其偶聯的配基組成，配基的性質和密度決定了親和色譜的選擇性和純化效率[10-11]?，F今關于采用親和色譜對糖蛋白，尤其是凝集素蛋白的分離純化應用研究報道較少，且親和體系應用效果多不理想[12]。作為應用最廣泛的一類配基，三嗪型染料汽巴藍F3GA具有價格低廉、化學物理性能穩(wěn)定、不易被生物降解[8,13]等特點，目前已成功應用于一些蛋白質和酶的分離純化[14-15]。從分子結構看，汽巴藍F3GA由三嗪環(huán)、多芳香環(huán)和離子磺酸基團3 個部分組成，和N-乙酰葡萄糖胺結構相似，都含有氨基、羰基及六元環(huán)。鑒于黑蕓豆凝集素對N-乙酰葡萄糖胺具有特異性識別作用[5]，推測汽巴藍F3GA與凝集素之間可能存在一定的特異性親和作用。因此，本實驗采用偶聯染料配體汽巴藍F3GA的方法進行凝集素的分離純化，這將具有極大的應用潛力和發(fā)展空間。

本實驗以瓊脂糖為原料，采用反相懸浮再生法制備瓊脂糖微球，并對瓊脂糖微球進行環(huán)氧氯丙烷的交聯及配基汽巴藍F3GA偶聯。采用掃描電子顯微鏡、激光粒度分析儀、傅里葉變換紅外光譜等方法對微球進行表征，并研究活性染料微球對黑蕓豆凝集素的吸附性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑蕓豆 安徽省合肥市寧國路農產品批發(fā)市場；黑蕓豆凝集素（純度≥95%）由哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院食品安全實驗室饋贈[7,16]。0.45 μm混合纖維素脂微孔濾膜 上海半島實業(yè)有限公司；吐溫-80、司班80、瓊脂糖與活性炭 上海阿拉丁試劑公司；汽巴藍F3GA（分析純） 加拿大Bio Basic公司；考馬斯亮藍R-250/G-250、4×上樣緩沖溶液、蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均為國產分析純；全部實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

96 孔U型板 江蘇世泰實驗器材有限公司；中藥粉碎機 上海頂帥電器有限公司；CP114電子天平 美國奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；DELTA 320 pH計瑞士梅特勒-托利多公司；RH basic 2磁力攪拌器德國艾卡（廣州）儀器設備有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京林茂科技有限公司；UV-4802雙光束紫外-可見分光光度計 美國尤尼柯（上海）儀器有限公司；BJ-9300HJ激光粒度分析儀丹東百特儀器公司；JSM-6490LV型鎢燈絲掃描電子顯微鏡 日本電子公司；67型傅里葉變換紅外光譜儀美國Nicolet儀器公司；DYY-10C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；AKTApurifier 100蛋白純化儀 美國GE公司；e2695型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統（配有UV-2489紫外檢測器） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 活性瓊脂糖微球的制備

1.3.1.1 反相懸浮再生法制備瓊脂糖微球

參照尹霜霜等[17]的方法制備瓊脂糖（agarose）微球。首先取6.0 g瓊脂糖和1.0 g NaCl置于100 mL超純水中，加熱溶解制得6 g/100 mL瓊脂糖溶液。然后在500 mL三口圓底燒瓶中，加入150 g真空泵油和一定質量的乳化劑（30 g吐溫-80、15 g司班80），70 ℃水浴攪拌30 min，轉速為800 r/min。趁熱加入瓊脂糖溶液，繼續(xù)攪拌30 min。整個過程均在70 ℃恒溫水浴中進行。隨后，低速攪拌（140～200 r/min），緩慢降至室溫，再繼續(xù)將溫度降至15 ℃以下，冷凝成型，超純水將瓊脂糖微球洗滌干凈，用標準篩網濕態(tài)篩選粒徑為30～150 μm的瓊脂糖微球；體積分數20%（下同）乙醇溶液封存，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 瓊脂糖微球的交聯

在生物大分子分離純化中，瓊脂糖微球在不經過任何的化學修飾情況下，機械強度低，不適合直接偶聯鍵合功能基團[18]。為最大程度提高瓊脂糖微球的機械強度，本實驗擬對瓊脂糖微球進行兩次交聯，反應方程式如式（1）所示。具體操作為：準確稱取2 mL的瓊脂糖微球，與等體積的1 mol/L的NaOH溶液混合，加入100 μL 5 g/L的NaBH4，于25 ℃條件下反應4 h。反應結束后，過濾，加入蒸餾水反復洗滌，直到中性，然后將交聯后的瓊脂糖微球按照上述方法進行二次交聯，再次過濾，加入蒸餾水反復洗滌至中性且濾液中無環(huán)氧基檢出，完成兩次交聯，抽干，收集備用。

1.3.1.3 瓊脂糖微球配基（汽巴藍F3GA）的偶聯

配基（汽巴藍F3GA）的偶聯過程如式（2）所示。稱取1.3.1.2節(jié)制備好的高度交聯的瓊脂糖微球1.0 g于100 mL的三口燒瓶中，加入20 mL超純水，待瓊脂糖微球充分溶脹后，將三口燒瓶置入50 ℃的恒溫水浴中。在磁力攪拌器不斷攪拌下（300 r/min），將1.0 g活性染料汽巴藍F3GA溶于15 mL超純水中，充分溶解后加入到三口燒瓶中，反應60 min后，加入6 mL質量分數為20% NaCl溶液。隨后，用2 mol/L的NaOH溶液調節(jié)溶液的pH值為9～10，反應時間為10 h。反應結束后，趁熱抽濾，用超純水洗滌至無色，然后依次用甲醇、2 mol/L NaCl、體積分數20%乙醇溶液、熱水充分洗滌，得到以汽巴藍F3GA為功能配基的染料介質Blue Beads 6FF，于體積分數20%的乙醇溶液中儲存?zhèn)溆?。收集所有的洗滌液，調至中性，定容，測溶液中活性染料配基汽巴藍F3GA在620 nm波長處的吸光度。根據吸光度算出洗滌溶液中活性染料汽巴藍F3GA的含量，并用其與染料加入量的差值計算出染料配基汽巴藍F3GA的偶聯量[19]。

1.3.2 活性Blue Beads 6FF微球的表征

采用掃描電子顯微鏡觀察微球粒徑及形貌。

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定活性微球Blue Beads 6FF的紅外光譜，通過KBr壓片，檢測波數范圍為4 000～400 cm-1。

參照Huang Yongdong等[20]的方法利用AKTApurifier 100蛋白純化儀進行微球壓力流速曲線的測定。

參照Zhang Lina等[21]的方法進行微球溶脹率、孔隙率及配基泄漏率的測定。

將制備好的活性微球Blue Beads 6FF用超純水充分溶脹，用濾紙將表面水分吸凈后，測濕質量為mw，然后放置于烘箱中60 ℃烘干至恒質量，測干質量為md。溶脹率的計算如公式（3）所示。

采用比重法測Blue Beads 6FF活性微球密度ρc/（g/mL），孔隙率Pr計算如式（4）所示。

式中：ρw為水的密度（1 g/mL）；Q為吸水量，Q＝（mw-md）/mw。

在配基泄漏率的測定過程中，移取0.2 mL活性微球Blue Beads 6FF于3 支4 mL離心管中，分別加入2 mL配制好的0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，25 ℃搖床振蕩5 d，6 000 r/min離心20 min，取上清液在620 nm波長處測汽巴藍F3GA的吸光度，并計算染料泄漏率[14]。

1.3.3 活性Blue Beads 6FF微球的吸附性能測定

1.3.3.1 微球對黑蕓豆凝集素的吸附量

取平衡好的活性Blue Beads 6FF微球1 mL，置于7 個50 mL錐形瓶中，依次加入10 mL質量濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的凝集素溶液（純度≥95%）（pH 7.2，10 mmol/L磷酸鹽緩沖液），在25 ℃下搖床振蕩吸附24 h，取上清液，測定蛋白質量濃度，計算出活性微球的吸附量，并以Langmuir吸附等溫式（式（5））進行吸附性能擬合[17]。

式中：q為吸附量/（mg/mL）；qm為最大吸附量/（mg/mL）；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；Kd為蛋白解離常數/（mg/mL）。

1.3.3.2 吸附時間對黑蕓豆凝集素吸附的影響

分別取平衡好的活性Blue Beads 6FF微球1 mL，置于8 個50 mL錐形瓶中，均加入10 mL質量濃度為2.0 mg/mL的黑蕓豆凝集素溶液（pH 7.2、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液），在25 ℃下搖床振蕩吸附，分別測定0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h和8.0 h上清液蛋白質量濃度，計算出活性微球在不同時間的吸附量。

1.3.3.3 蛋白質量濃度測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質量濃度，以牛血清白蛋白為標準，所得回歸方程為：y＝1.492 8A+0.039 6（R2＝0.996 9）。

1.3.4 黑蕓豆凝集素的親和層析純化

1.3.4.1 色譜柱的填裝

稱取制備好的150 mL活性Blue Beads 6FF微球，用500 mL勻漿液分散后加入勻漿罐中，采用高壓泵封閉灌裝；流速由零開始慢慢調高，利用流速調整壓力，壓力不宜超過30 MPa，裝完之后用體積分數20%乙醇溶液封裝，4 ℃環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 黑蕓豆凝集素的浸提和粗分離

黑蕓豆子葉經中藥粉碎機粉碎，過80 目篩，稱取20 g粉末于500 mL燒杯中，加入200 mL 10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液，磁力攪拌浸提12 h后高速離心（9 000 r/min、30 min）獲得浸提液。然后調pH值至3.5，于4 ℃環(huán)境靜置1 h后，高速離心（9 000 r/min、30 min），取上清液并采用50 kDa的超濾離心管超濾離心（4 000 r/min、20 min），然后將濾過液體重新調回pH值至7.2，再用50 kDa超濾離心管超濾（4 000 r/min、20 min），收集未濾過液體得到粗分離樣品，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 黑蕓豆凝集素親和層析純化

將得到的黑蕓豆凝集素粗品（30 mL、（9.56±0.52）mg/mL）上樣于裝好的Blue Beads 6FF柱中（柱體積150 mL），進行色譜純化。平衡液與洗雜液均為10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，洗脫液為10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液和0.25 mol/L的NaCl溶液，流速為2.5 mL/min，收集各洗雜峰與洗脫峰并進行凝血活性的檢測。質量分數2%的兔血紅細胞壓積溶液為實驗室自制，制備方法及凝血活性實驗參照He Shudong等[7,16]的報道進行，根據式（6）～（8）計算黑蕓豆凝集素的純化倍數、蛋白得率及蛋白回收率。

1.3.4.4 高效液相凝膠排阻色譜分析

采用e2695系列HPLC系統進行高效液相凝膠排阻色譜（HPLC-gel permeation chromatography，HPLC-GPC）分析，計算凝集素蛋白含量。排阻色譜柱型號為TSKgel G3000SWxl（300 mm×7.8 mm），平衡緩沖液和洗脫緩沖液均為10 mmol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（含0.05%的疊氮化鈉和0.1 mol/L的硫酸鈉），流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，進樣前樣品過0.22 μm膜，檢測波長為280 nm。

1.3.4.5 SDS-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析采用Laemmli等[22]的方法，分離膠與濃縮膠的質量分數分別為12%與4%，取200 μL樣品，按體積比1∶3加入4×上樣緩沖液，漩渦振蕩充分混勻后，沸水浴5 min，高速離心（10 000 r/min，10 min）取上清液進行上樣，每孔上樣量均為15 μL。電泳條件為起始電壓80 V，溴酚藍前沿到達分離膠后升至120 V。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250進行染色，脫色后，電泳結果采用1600全自動數碼凝膠圖像儀拍照進行分析。

1.4 數據分析

每次實驗均重復3 次，利用SPSS 20.0軟件對實驗結果進行統計分析，數據以平均值±標準偏差表示，采用Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 活性Blue Beads 6FF微球的形貌

實驗中制備的活性Blue Beads 6FF微球，為肉眼可見的細小藍色顆粒，呈圓球狀，無雜質。掃描電子顯微鏡觀察表明，微球呈完整的球形，圓滑無破損，微球粒度分散比較均勻，呈單分散性，粒徑在45～65 μm之間（圖1）；由圖1c的單顆粒表征可知，活性微球表面具有許多細小的溝紋，無碎片附著。以上結果表明，反相懸浮再生法所制備的瓊脂糖微球的球形度良好。

圖1 活性Blue Beads 6FF微球的鎢燈絲掃描電子顯微鏡圖Fig.1 SEM images of Blue Beads 6FF microspheres

圖2 Blue Beads 6FF的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of Blue Beads 6FF microspheres

合適的粒徑分布對于吸附過程起著重要作用[23]。如圖2所示，活性Blue Beads 6FF微球的粒徑較為均勻，主要分布在45～65 μm范圍內，平均粒徑為56.37 μm，這與市場上常見的瓊脂糖微球產品的數據基本一致，不僅可以保證裝柱的均勻性，同時可以確保流速穩(wěn)定，利于待分離樣品在固定相中的物質分配[24]。

2.2 活性Blue Beads 6FF微球傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 高度交聯的瓊脂糖微球與Blue Beads 6FF的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of highly cross-linked agarose and Blue Beads 6FF microspheres

由圖3可知，高度交聯的瓊脂糖（偶聯汽巴藍F3GA前的樣品）與活性Blue Beads 6FF微球在3 376、2 921 cm-1和1 049 cm-1出現一致的吸收峰，分別歸屬于瓊脂糖的O—H，C—H及瓊脂糖交聯環(huán)氧氯丙烷后產生的C—O—C的伸縮振動[17]。當汽巴藍F3GA偶聯之后，活性Blue Beads 6FF微球在1 652、1 421、1 371 cm-1和1 288 cm-1處出現4 個新的紅外吸收峰，其中，1 652 cm-1處為C＝O的伸縮振動吸收峰，1 421 cm-1為三嗪環(huán)的特征吸收，1 371 cm-1和1 288 cm-1為C—N的伸縮振動吸收峰[25]。以上結果表明，染料配基汽巴藍F3GA已成功固載于交聯的瓊脂糖微球。

2.3 活性Blue Beads 6FF微球的物理性能

活性Blue Beads 6FF微球的物理性能如表1所示。測得活性染料配基汽巴藍F3GA的偶聯量為7.23 μmol/mL，表明配體偶聯效果良好?；钚訠lue Beads 6FF微球的濕密度為1.26 mg/mL，溶脹率為266.67%，與市場上常見的瓊脂糖微球產品的數據基本一致?？紫堵蕿?7.74%，孔隙率良好，有利于蛋白吸附。染料配基汽巴藍F3GA在0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl和10 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中泄漏率為零，具有寬范圍的pH值穩(wěn)定性，表明染料偶聯穩(wěn)定。

表1 Blue Beads 6FF的理化性質Table1 Physical properties of Blue Beads 6FF

2.4 活性Blue Beads 6FF微球壓力流速曲線

通過壓力流速曲線來表征填料微球的機械強度。由圖4可知，實驗制備的活性Blue Beads 6FF微球最大耐受壓力為0.25 MPa，最大耐受流速為700 cm/h，機械強度顯著增強。本實驗制備的瓊脂糖微球經過兩次交聯，介質的交聯度大，故可以耐受更大的流速，擴大親和介質的適用性[26]。

圖4 Blue Beads 6FF的壓力流速曲線Fig.4 Pressure-flow velocity curve of Blue Beads 6FF

2.5 活性Blue Beads 6FF微球的凝集素吸附性能

圖5 吸附時間對Blue Beads 6FF吸附黑蕓豆凝集素的吸附量影響（a）及吸附等溫線（b）Fig.5 Adsorption capacity as a funtion of adsorption time of Blue Beads 6FF toward lectin from black kidney beans (a) and adsorption isotherms (b)

吸附時間對吸附量的影響如圖5a所示。吸附開始時，液相中凝集素蛋白的濃度較高，溶液中和固相（活性微球）間的蛋白質量濃度差大，因此有著較高的吸附速率；隨著吸附的進行，溶液中剩余的凝集素蛋白質量濃度逐漸減小，質量濃度差減小，導致吸附速率下降[27]，4 h時達到吸附飽和，此時吸附量為15.32 mg/mL。

從圖5b中可以看到，當黑蕓豆凝集素質量濃度處于0～1 mg/mL時，吸附量隨蛋白質量濃度的增加近似呈線性增長；隨著蛋白質量濃度的增加，吸附量提高幅度逐漸降低，并趨于平緩。根據Langmuir曲線擬合得到Blue Beads 6FF微球的最大蛋白吸附量為19.7 mg/mL，解離常數Kd為0.68 mg/mL，表明本實驗得到的染料配體對黑蕓豆凝集素具有較好的特異性親和力。

2.6 黑蕓豆凝集素親和層析純化

圖6 黑蕓豆凝集素分離純化SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of black kidney bean lectin after isolation and purification

如圖6所示，黑蕓豆蛋白浸提液經過酸堿調節(jié)及超濾離心粗分離后，分子質量大于32 kDa的雜蛋白大部分被去除。由于天然狀態(tài)下的黑蕓豆凝集素為四聚體（分子質量為120 kDa左右），在低酸性（pH 3.5）條件下凝集素蛋白會解聚為單聚體（分子質量為30 kDa左右）[28-29]，因此，可利用50 kDa超濾離心管將大分子質量的雜蛋白大量去除。待溶液調pH值至7.2后，凝集素重新聚合為四聚體形式，可采用50 kDa超濾離心管去除小分子蛋白和鹽離子。如表2所示，浸提液及超濾分離粗品的凝血活力分別為（1.45×103）HU/mg和（2.82×103）HU/mg，說明粗分離后黑蕓豆凝集素的含量較高，凝集素得到有效富集，此時超濾分離凝集素純化倍數為1.94 倍，蛋白得率為（51.61±1.26）mg/g，蛋白回收率為（42.83±0.26）%。

表2 Blue Beads 6FF親和層析純化凝集素步驟總結Table2 Summary of purification procedures of lectin from black kidney bean through Blue Beads 6FF affinity chromatography

傳統凝集素提取經過硫酸銨分級沉淀、離子交換色譜及分子排阻色譜等多步色譜純化，時間長、成本高、純化得率低[30-31]，黑蕓豆凝集素的最終得率僅為（0.65±0.13）mg/g[7]。Ren Jiaoyan等[32]采用Tg-Sepharose親和層析，顯著提高了紅蕓豆凝集素的提取率，最終可達到（3.4±0.3）mg/g，表明親和層析可以高效地被用于動植物凝集素的一步分離純化[10]，但是，這類天然的生物大分子配基本身需要純化分離而獲得，制備過程復雜且價格昂貴，同時，不易保持其生物活性[8,33]。因此，價格低廉、化學物理性能穩(wěn)定，且不易被生物降解活性染料類配基已經成為目前的研究熱點[14-15]。活性染料類配基是一類易于人工合成的、具有生物相似活性的小分子化合物，其中，三嗪型染料汽巴藍F3GA應用最為廣泛。研究表明，三嗪型染料汽巴藍F3GA的分子結構包括3 個部分，即三嗪環(huán)、多芳香環(huán)和離子磺酸基團，可被固載于一些固相基質上，用于分離純化干擾素，白蛋白和需要輔因子（如NAD、NADH、NADP和NADPH）活化的酶等[15,34]。本實驗發(fā)現，采用汽巴藍F3GA為配基活性Blue Beads 6FF微球對黑蕓豆凝集素蛋白具有一定的親和選擇吸附性，這可能是由于汽巴藍F3GA與N-乙酰葡萄糖胺具有相似的氨基、羰基及六元環(huán)結構所致[14-15]，而N-乙酰葡萄糖胺是黑蕓豆凝集素蛋白的特異性識別糖基配體[5]。由表2可知，本實驗方法凝集素含量為（0.96±0.05）mg/mg，蛋白得率和純化時間顯著優(yōu)于傳統方法，且親和填料制備成本顯著降低。

圖7 黑蕓豆凝集素的Blue Beads 6FF吸附洗脫曲線（a）及HPLC-GPC（b）Fig.7 Adsorption and desorption profiles of Blue Beads 6FF (a) and HPLC-GPC (b) toward lectin from black kidney bean

3 結 論

本研究以兩次交聯環(huán)氧氯丙烷的6 g/100 mL瓊脂糖為固相載體，偶聯染料配體汽巴藍F3GA制備了一種新型高效染料親和色譜介質Blue Beads 6FF，該親和染料介質粒徑均一，具有高的孔隙率、溶脹率及寬范圍的pH值穩(wěn)定性，且耐壓能力強，對黑蕓豆凝集素蛋白具有良好的親和色譜分離性能，經一步親和色譜純化后凝集素含量可達（0.96±0.05）mg/mg，相對于傳統方法及其他親和介質具有顯著的效率和成本優(yōu)勢，同時，可為其他種類凝集素和一些糖蛋白的快速分離純化提供新的研究思路。