■黃文福 牛 春 孫金剛 張瑞敏 張 萍

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川750100）

金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）是鏈霉菌（Streptomyces）的一種，因能產(chǎn)生金霉素（Chlortetracycline，即CTC）而得名。金霉素是屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素，在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途，尤其在畜牧業(yè)上是用于飼料藥物添加劑的八大抗生素產(chǎn)品之一[1]。為了提高金霉素的產(chǎn)量，從很多角度進(jìn)行了探索。一方面，通過(guò)不斷對(duì)金色鏈霉菌品種的改良，獲得高效價(jià)穩(wěn)定的菌株；另一方面，通過(guò)先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)不斷對(duì)金色鏈霉菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期待得到更高的金霉素產(chǎn)出率。

本研究主要以金色鏈霉菌抗性菌為試驗(yàn)菌株，通過(guò)向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)探索發(fā)酵增效劑在優(yōu)化配方中的添加對(duì)金霉素發(fā)酵效價(jià)的提高效果，為工業(yè)生產(chǎn)中提高金霉素產(chǎn)出率提供一定的理論基礎(chǔ)和參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金色鏈霉菌抗性菌(Streptomyces aureus)CTCⅡ15-590由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參考軒海連的方法[2]

1.1.2.1 種子培養(yǎng)基

玉米淀粉4.0%、黃豆粉2.0%、氯化鈉0.2%、硫酸銨0.3%、碳酸鈣0.4%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.025%、培養(yǎng)基裝量30 ml/300 ml三角瓶，在溫度(29.0±0.5)℃，轉(zhuǎn)速260 r/min條件下培養(yǎng)22 h。

1.1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米淀粉10%、花生粉1.5%、黃豆粉2.5%、淀粉酶(沈丘酶制劑廠生產(chǎn)，酶活2 000 IU/ml)0.004%、氯化鈉0.25%、硫酸銨0.5%、碳酸鈣0.7%、蛋白胨1.4%、酵母粉0.2%、硫酸鎂0.025%、豆油1.25 ml/30 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝量30 ml/300 ml三角瓶，在溫度(29.0±0.5)℃,轉(zhuǎn)速260 r/min條件下培養(yǎng)166 h。

1.1.3 試劑

硫酸亞鐵、硫酸銅、鹽酸甜菜堿和氯化鈷均為分析純；發(fā)酵增效劑均購(gòu)于四川樂(lè)山市五通橋生物化工廠。

1.2 方法

1.2.1 斜面制備

將沙土孢子傳到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)96 h后，保藏待用。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵方法

首先，用無(wú)菌水將斜面上成熟的孢子洗下，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無(wú)菌50 ml三角瓶中，在搖床上振蕩10～20 min，使孢子充分分散，得到孢子懸液。其次，將1 ml孢子懸液轉(zhuǎn)入滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的300 ml三角瓶中，培養(yǎng)22 h。最后，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)12%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌的裝有添加不同濃度梯度的微量元素與發(fā)酵增效劑的發(fā)酵培養(yǎng)基的300 ml三角瓶中，用正常培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)166 h。

1.2.3 單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)是目前最普遍采用的一種試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，它僅考察一個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)構(gòu)成影響。本文首先對(duì)4種微量元素和6種發(fā)酵增效劑進(jìn)行單因素考察。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1和表2。

表1 因素(微量元素)-水平

表2 因素(發(fā)酵增效劑)-水平

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]是研究多因素多水平以部分代表性的點(diǎn)代替全面試驗(yàn)，尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。分別選取3種微量元素進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)試驗(yàn)考察。最后得到最優(yōu)的水平組合,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表3。

表3 三因素(微量元素)三水平正交試驗(yàn)

1.2.4 檢測(cè)方法

發(fā)酵液中金霉素發(fā)酵單位采用比色法測(cè)定，待發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵搖瓶置于平板上，向搖瓶的發(fā)酵液中加入適量固體草酸并混勻，酸化30 min后,將發(fā)酵液過(guò)濾；吸取0.1 ml濾液，加入到準(zhǔn)備好的50 ml容量瓶（預(yù)先加入2 mol/l鹽酸5 ml）中，熱水浴5 min；待溶液冷卻后，加純化水定容至50 ml，空白不進(jìn)行水??；用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)440 nm下測(cè)定紫外吸收值(OD值)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵單位。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均采用Spass軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銅、硫酸亞鐵、鹽酸甜菜堿和氯化鈷對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響

由圖1可以看出，硫酸亞鐵、硫酸銅和鹽酸甜菜堿對(duì)金色鏈霉菌搖瓶發(fā)酵效價(jià)有促進(jìn)作用，而氯化鈷對(duì)其有抑制作用。硫酸亞鐵在濃度0.002%時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照提高15.9%；硫酸銅在濃度0.005%時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照提高6.9%；鹽酸甜菜堿在濃度0.03%時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照提高9.6%；而氯化鈷在濃度0.004%時(shí)抑制作用最為明顯，較對(duì)照降低28.3%。因此可在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定濃度梯度的硫酸亞鐵、硫酸銅和鹽酸甜菜堿以提高發(fā)酵效價(jià)。

圖1 4種微量元素對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響

2.2 微量元素組合對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響

由表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，A1平均發(fā)酵效價(jià)為8 973 U/ml，A2平均發(fā)酵效價(jià)為8 632 U/ml，A3平均發(fā)酵效價(jià)為 8 497 U/ml，極差為 476 U/ml；B1平均發(fā)酵效價(jià)為8 927 U/ml，B2平均發(fā)酵效價(jià)為8 703 U/ml，B3平均發(fā)酵效價(jià)為 8 476 U/ml，極差為 451 U/ml；C1平均發(fā)酵效價(jià)為8 803 U/ml，C2平均發(fā)酵效價(jià)為8 842 U/ml，C3平均發(fā)酵效價(jià)為 8 459 U/ml，極差為383 U/ml；因此，各因素對(duì)發(fā)酵效價(jià)指標(biāo)影響的主次順序依次為：A＞B＞C。則選取最優(yōu)的組合條件是A1B1C2，即在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.001%硫酸亞鐵、0.004%硫酸銅和0.03%鹽酸甜菜堿。

表4 微量元素組合影響金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià) L9(34)正交試驗(yàn)方案及計(jì)算表

2.3 發(fā)酵增效劑對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響（見(jiàn)圖2）

由圖2可以看出，G型發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響有一定的作用，低濃度時(shí)具有促進(jìn)作用，在0.02%濃度時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照高8.1%。F型發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響有一定的作用，低濃度時(shí)具有促進(jìn)作用，在0.02%濃度時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照高7.2%。菜籽餅粉發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響有一定的作用，高濃度時(shí)具有抑制作用；在0.04%濃度時(shí)抑制作用最明顯，較對(duì)照低9.9%。A型發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響有促進(jìn)作用。E型發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響無(wú)變化。甲型發(fā)酵增效劑對(duì)搖瓶效價(jià)影響有一定的作用，低濃度時(shí)具有促進(jìn)作用，在0.01%濃度時(shí)促進(jìn)作用最明顯，較對(duì)照高9.1%。因此，可以在發(fā)酵過(guò)程中，添加一定濃度的G型發(fā)酵增效劑、F型發(fā)酵增效劑和甲型發(fā)酵增效劑以提高發(fā)酵效價(jià)。

圖2 6種發(fā)酵增效劑對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響

2.4 微量元素與發(fā)酵增效劑組合對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 微量元素和發(fā)酵增效劑組合對(duì)金色鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)影響

由圖3可知，A、B、C和D四組試驗(yàn)組的搖瓶發(fā)酵效價(jià)均高于對(duì)照組，且與對(duì)照組之間差異顯著。A組與B組和D組的搖瓶發(fā)酵效價(jià)之間差異顯著，與C組搖瓶發(fā)酵效價(jià)差異不顯著。B、C組和D組之間的搖瓶發(fā)酵效價(jià)差異不顯著，但D組搖瓶發(fā)酵效價(jià)高于C組和B組。A組發(fā)酵效價(jià)比CK組高17.3%；B組發(fā)酵效價(jià)比A組提高5.1%；C組發(fā)酵效價(jià)比A組提高了3.4%，D組發(fā)酵效價(jià)比A組提高了6.4%。因此，添加一定量的微量元素和發(fā)酵增效劑可以提高金色鏈霉菌的生產(chǎn)發(fā)酵能力。

3 結(jié)論與討論

金霉素的生物合成過(guò)程受多種酶的控制和調(diào)節(jié)，扶教龍等[4]已證明在培養(yǎng)48 h以上的過(guò)程菌株中丙酮酸激酶和丙酮酸脫氧酶的活力都很低。同時(shí)，在金色鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中，特別是金霉素合成的旺盛期，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力很高。而金屬離子對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有較強(qiáng)的激活作用。王鵬飛[5]已證明在72 h添加1 mg/kg一水硫酸亞鐵1.4 ml，或在72 h加l%七水硫酸鎂0.5 ml均可使金霉素的發(fā)酵水平得到較大幅度提高。另一方面，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為參與四環(huán)類抗生素生物合成過(guò)程最后幾步反應(yīng)的酶，如SAM供給不足，四環(huán)類抗生素合成則受到影響[5]。甜菜堿及其鹽酸鹽作為一種高活性甲基供體，在甲基代謝中起著重要的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用，通過(guò)甲基循環(huán)途徑，甜菜堿實(shí)現(xiàn)3個(gè)活性甲基對(duì)甲基受體的供給[6]。應(yīng)惟媧等[7]指出，甜菜堿是最有效的甲基供體，它的三個(gè)甲基基團(tuán)都可以作為有效的活性甲基，其中一個(gè)使高半胱氨酸甲基化，形成內(nèi)源甲硫氨酸和二甲基甘氨酸，內(nèi)源甲硫氨酸通過(guò)形成S-腺苷甲硫氨酸釋放甲基，二甲基甘氨酸通過(guò)釋放甲基形成5-甲基四氫葉酸，而5-甲基四氫葉酸又是高半胱氨酸合成甲硫氨酸的甲基供體，甲硫氨酸必須經(jīng)甲基循環(huán)轉(zhuǎn)變成S-腺苷甲硫氨酸，才能作為甲基供體。甜菜堿能代替價(jià)格較高的S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，降低生產(chǎn)成本。因此，本文通過(guò)向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸銅、硫酸亞鐵和鹽酸甜菜堿，使得金色鏈霉菌的發(fā)酵效價(jià)提高了17.3%。進(jìn)一步在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加一定發(fā)酵增效劑，可以顯著提高金色鏈霉菌的生產(chǎn)發(fā)酵水平，分別添加0.02%G型發(fā)酵增效劑、0.02%F型發(fā)酵增效劑和0.01%甲型發(fā)酵增效劑，可使發(fā)酵效價(jià)又提高5.1%、3.4%和6.4%。