章帥 黃迪 王曉元 李曙光

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科（河北張家口 075000）

無(wú)論在世界范圍內(nèi)還是在中國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均居于癌癥相關(guān)疾病的前五位，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身心健康［1-2］。盡管結(jié)直腸癌的手術(shù)、新輔助化療、輔助化療和靶向治療等各種治療策略取得了很大進(jìn)展，但結(jié)直腸癌的預(yù)后，尤其晚期患者的預(yù)后仍然不是十分樂(lè)觀(guān)。因此，有必要深入了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尤其是遠(yuǎn)處擴(kuò)散的分子機(jī)制。在過(guò)去的幾十年里，諸多學(xué)者探索了結(jié)直腸癌相關(guān)診斷、判斷預(yù)后的各種分子標(biāo)記物和潛在分子機(jī)制，但均未發(fā)現(xiàn)能用于臨床診斷和治療的有效分子或明確結(jié)直腸癌的進(jìn)展機(jī)制［3］。最近，有證據(jù)［4-5］表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA也可作為結(jié)直腸癌進(jìn)展的調(diào)節(jié)劑，并且具有作為新的治療靶點(diǎn)的潛力。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，作為一種新的基因調(diào)控分子，不具有編碼蛋白質(zhì)的潛力［6］。有研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA廣泛的存在于細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程中，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［7］、細(xì)胞侵襲遷移［8］和分化［9］等。同樣，長(zhǎng)鏈非編碼RNA的異常表達(dá)也參與調(diào)節(jié)了許多腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)展，包括結(jié)直腸癌。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA PINT（linc-PINT），是在人體中普遍表達(dá)并由p53誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。有研究已經(jīng)證明linc-PINT通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和DNA損傷來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖［10］。此外，LI等［12］研究發(fā)現(xiàn)，linc-PINT在胰腺癌患者血清中顯著低表達(dá)，并且其低表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良顯著相關(guān)，有望成為胰腺癌早期診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)記物。然而，linc-PINT在結(jié)直腸癌中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)研究。因此，本研究首先檢測(cè)其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平，進(jìn)而檢測(cè)其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，并初步探索其調(diào)控結(jié)直腸癌進(jìn)展的分子機(jī)制，為探索結(jié)直腸癌診斷標(biāo)記物，為監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸，為結(jié)直腸癌靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及組織本研究納入我院2012年1月至2012年12月確診為結(jié)腸癌且資料完整的病例60例，所有患者術(shù)前均未接受除手術(shù)以外的其他抗腫瘤治療，60例患者均獲得新鮮結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織。采用電話(huà)或病案系統(tǒng)對(duì)60例患者從術(shù)后第一天開(kāi)始隨訪(fǎng)，內(nèi)容主要包括患者復(fù)查結(jié)果和生存情況，隨訪(fǎng)至2017年6月21日或者患者死亡。

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，SW620，HT29，LoVo，HCT116、RKO細(xì)胞和正常結(jié)腸粘膜細(xì)胞NCM460購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，并由我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳代培養(yǎng)和保存。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）、100 U/mL青霉素（Sigma-Aldrich，美國(guó)）和100 μg/mL鏈霉素（Sigma-Aldrich，美國(guó)）的Dulbecco′s Modified Essential Medium（DMEM）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將細(xì)胞放置在37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑RNA trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；linc-PINT（Forward：CGTGGGAGCCCCTTTAAGTT，Reverse：GGGAGGTGGCGTAGTTTCTC）、SMAD4（Forward：GCTGCAGAGCCCAGTTTAGA，Reverse：CCCCAAAGCAGAAGCTACGA）和 GAPDH（Forward：CCTCTGACTTCAACAGCGACAC，Reverse：TGGTCCAGGGGTCTTACTCC）引物由生工生物（北京）有限公司設(shè)計(jì)合成；linc-PINT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司提供；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)life公司；培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒由日本同仁公司提供；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)康寧公司；SMAD4購(gòu)自Abcam公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（1）鋪板：轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于6孔板，每個(gè)組有三個(gè)復(fù)孔，保證第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度可以達(dá)到70%。（2）轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前每個(gè)6孔板更換為新的1.8 mL完全培養(yǎng)基。按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟，分別稀釋過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。6孔板：在每個(gè)1.5 mL無(wú)菌EP管中分別加入125 μL Opti-MEM，然后向每個(gè)EP管中加入2.5 μg pcDNA3.1-linc-PINT得到質(zhì)粒稀釋液；向另外3個(gè)EP管中加入2.5μl Lipofectamine?3000，得到Lipofectamine?3000稀釋液；迅速將上述兩種液體輕輕混勻，室溫孵育5 min。（3）將上述混合液加入到6孔板中，輕輕混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后收獲細(xì)胞，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）提取總RNA：稱(chēng)取30 mg組織（6孔板中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞）加入500 μL TRIzol裂解5 min，然后加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，12 000轉(zhuǎn)離心15 min，將上層透明液體移入新的EP管中，加入250 μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清液，用75%乙醇溶液（DEPC：無(wú)水乙醇=1：3）洗滌沉淀3次，每次7 500轉(zhuǎn)離心5 min），待沉淀基本透明時(shí)加入DEPC水，58℃水浴至充分溶解，測(cè)定RNA的濃度及質(zhì)量。

按照takara RR036A試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在10 μL反應(yīng)體系中加入500 ng總RNA。按照伯樂(lè)qPCR檢測(cè)試劑盒通過(guò)qRT-PCR測(cè)定linc-PINT的表達(dá)水平，用2×SYBR Green PCR Master Mix，取0.8 μL上述步驟得到的cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，10 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，使用CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)。人GAPDH作為內(nèi)參。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，目的基因的表達(dá)水平應(yīng)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)（1）鋪板：收集細(xì)胞，消化、離心，制成單細(xì)胞懸液，混勻計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL。在96孔板中每孔加入100 μL單細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。（2）檢測(cè)：第一天在細(xì)胞貼壁2 h后檢測(cè)，隨后在24、48、72、96 h同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)共5 d。檢測(cè)時(shí)，更換96孔板中的培養(yǎng)基，向每個(gè)孔加入CCK-8試劑10 μL，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度，波長(zhǎng)在450 nm。（3）繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)：以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6Transwell遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel基質(zhì)膠置于4℃過(guò)夜融化。EP管、槍頭等實(shí)驗(yàn)耗材置于-20℃預(yù)冷。（1）鋪板：收集細(xì)胞，消化離心，用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，將含有6×104個(gè)細(xì)胞的200 μL懸液加到上室，在下室加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。（2）固定、染色：培養(yǎng)48 h后，倒掉上室中的液體，用PBS清洗3次，4%甲醛固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min，加入0.1%結(jié)晶紫水溶液染色10 min，PBS清洗3次，每次5 min，用棉簽輕輕擦掉未發(fā)生遷移的細(xì)胞。（3）拍照、細(xì)胞計(jì)數(shù)：將小室晾干，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀(guān)察、拍照并計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。

1.7Western blot（1）向6孔板中加入500 μL裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1配制），冰上充分裂解30 min，4℃，12 000 g離心30 min，取2 μL上清液應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余上清液加入5×Loading buffer（體積之比為 4∶1）混合均勻，100 ℃蛋白變性8 min。（2）根據(jù)蛋白分子量，按照凝膠配制成分表配制分離膠，上樣蛋白量為40 μg，設(shè)定電壓為100 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，取出分離膠，切取凝膠，設(shè)置電壓120 V，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜約1 h，完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h，取出PVDF膜放入一抗中（SMAD4，1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST清洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，顯影。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有細(xì)胞功能數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析；linc-PINT在腫瘤組織與正常組織間的表達(dá)水平采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，其與臨床病理特征的關(guān)系采用檢驗(yàn)和Fisher精確概率法分析計(jì)算，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法；P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Linc-PINT在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)Linc-PINT在60例結(jié)腸癌腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.35±0.80，顯著低于其在相應(yīng)正常組織中的3.67±1.56，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。Linc-PINT在 HCT116、HT29、LOVO、RKO、SW620和SW480等6種結(jié)腸癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于其在正常人結(jié)腸黏膜細(xì)胞NCM460中的相對(duì)表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中在RKO細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量最低（均P＜0.05，圖1B）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)Linc-PINT在結(jié)直腸癌中的表達(dá)Fig.1 The expression of Linc-PINT in colorectal cancer was detected using qRT-PCR

2.2Linc-PINT的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系以L(fǎng)inc-PINT在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平從高到低排序，以中位數(shù)為界，大于中位數(shù)為高表達(dá)組，小于中位數(shù)為低表達(dá)組。Linc-PINT低表達(dá)與患者的分期和肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)相關(guān)（均P＜0.05，表1），而與年齡、性別、腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等情況無(wú)明顯相關(guān)性（均P ＞0.05，表1）。

表1 Linc-PINT的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征間的關(guān)系Tab.1 Relationship between the linc-PINT expression and clinicopathological features of colorectal cancer patients

2.3 結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素生存分析單因素分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者的預(yù)后與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及l(fā)inc-PINT的表達(dá)顯著相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度等無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。linc-PINT低表達(dá)結(jié)腸癌患者的中位生存時(shí)間為33個(gè)月，明顯差于linc-PINT高表達(dá)患者60個(gè)月的中位生存時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.4 Linc-PINT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)linc-PINT對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)linc-PINT后，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖能力明顯下降（圖3A）；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)linc-PINT后，發(fā)生遷移的SW480細(xì)胞數(shù)顯著減少（279.0±11.14vs.109.0±7.41，P＜ 0.05）（圖3B）。結(jié)果提示linc-PINT可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

2.5 Linc-PINT與SMAD4在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)關(guān)系Pearson相關(guān)分析顯示，Linc-PINT在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與SMAD4在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖4A；r=0.592，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)linc-PINT后SMAD4蛋白的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。

表2 Linc-PINT的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后單因素分析Tab.2 Linc-PINT expression and univariate analysis of prognosis in patients with colorectal cancer

圖2 Linc-PINT低表達(dá)結(jié)直腸癌患者較高表達(dá)患者預(yù)后差Fig.2 Colorectal cancer patients with linc-PINT lowexpression have poor prognosis than patients with linc-PINT high expression

圖3 Linc-PINT抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.3 Linc-PINT inhibits proliferation and migration of colorectal cancer cells

圖4 Linc-PINT與SMAD4的關(guān)系Fig.4 Relationship between Linc-PINT and SMAD4

3 討論

結(jié)直腸癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后通常很差。目前，由于缺乏疾病早期特異性癥狀，許多結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)就已被確診為晚期，治療效果不佳［12］。因此，迫切需要新的診斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)來(lái)改善結(jié)直腸癌患者的結(jié)局。

近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)引起了全世界研究人員的興趣。許多長(zhǎng)鏈非編碼RNA在人類(lèi)腫瘤組織中異常表達(dá)并在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮不可忽視的作用［13］。其中，有研究發(fā)現(xiàn)linc-PINT能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并在胰腺癌患者中異常表達(dá)［10-11］。然而，目前仍不清楚linc-PINT是否以及如何調(diào)控結(jié)直腸癌患者的惡性生物學(xué)進(jìn)展。因此，在本研究中，筆者首次研究并報(bào)道了linc-PINT在60對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，linc-PINT在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈顯著低表達(dá)，提示linc-PINT可能在抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展中起重要作用。此外，分析linc-PINT的表達(dá)水平與60例結(jié)腸癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)linc-PINT的表達(dá)水平與患者腫瘤分期和肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，進(jìn)一步表明linc-PINT在結(jié)直腸腫瘤發(fā)展中起重要作用，提示其有望成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者病情進(jìn)展的分子之一。Kaplan-Meier分析顯示低水平的linc-PINT與結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明linc-PINT可能是結(jié)腸癌患者的新型預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步研究linc-PINT在結(jié)直腸癌中的作用，本研究繼續(xù)檢測(cè)了linc-PINT在6種結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480，SW620，HT29，LoVo，HCT116、RKO）及結(jié)腸正常粘膜細(xì)胞（NCM460）中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在6種結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)量均明顯低于其在NCM460中的表達(dá)水平，且SW480的表達(dá)最低，因此，我們選擇在SW480細(xì)胞中過(guò)表達(dá)linc-PINT進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)linc-PINT后，SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)能力顯著受到抑制，同樣，Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)linc-PINT對(duì)SW480細(xì)胞的遷移能力具有明顯的抑制作用。因此，這些觀(guān)察結(jié)果以及來(lái)自臨床研究的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明linc-PINT可能抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

另有研究［10］分析linc-PINT與KEGG信號(hào)通路的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，linc-PINT與TGF-β信號(hào)通路成正相關(guān)。而SMAD4作為T(mén)GF-β信號(hào)通路的重要介質(zhì)，在抑制腫瘤進(jìn)展和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［14-15］。同樣，Smad4突變和下調(diào)導(dǎo)致許多癌癥進(jìn)展，如Smad4低表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［16］；敲低SMAD4降低了肝癌細(xì)胞的集落形成和遷移能力［17］。SMAD4在結(jié)直腸癌中的作用也得到了廣泛研究，有研究［18］表明Smad4重新表達(dá)后增加了結(jié)直腸癌對(duì)小白菊內(nèi)酯的敏感性；MicroRNA-20a-5p通過(guò)下調(diào)Smad4促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移［19］；Smad4可以通過(guò)抑制VEGF-C的表達(dá)而減少淋巴管形成，進(jìn)而減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力［20］。以上研究提示linc-PINT可能通過(guò)提高SMAD4表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。因此，我們應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)SMAD4在60例結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Linc-PINT在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與SMAD4在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)。另外，過(guò)表達(dá)linc-PINT后，SMAD4的蛋白水平顯著升高。因此，這些結(jié)果初步表明，Linc-PINT通過(guò)SMAD4介導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，目前的研究表明linc-PINT在結(jié)腸癌腫瘤組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，linc-PINT可通過(guò)提高SMAD4表達(dá)水平來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移。linc-PINT在結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展中起重要作用，為診斷和監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌提供了候選生物標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌患者的治療提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。然而，本研究仍存在一定的局限性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中過(guò)表達(dá)linc-PINT進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，未經(jīng)過(guò)其他細(xì)胞敲低實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并且未進(jìn)行動(dòng)物模型的驗(yàn)證，Linc-PINT可能不僅僅通過(guò)SMAD4調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展，還存在多個(gè)途徑或其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)不足之處，我們下一步將在SW620細(xì)胞中敲低linc-PINT的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，通過(guò)裸鼠皮下成瘤和肝肺轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行驗(yàn)證，并通過(guò)信號(hào)通路芯片篩選Linc-PINT調(diào)控SMAD4的詳細(xì)機(jī)制。