胡艷艷 徐紅 朱仁杰 楊汝春 陳堅翱

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興中醫(yī)院（浙江嘉興 314001）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院（杭州 310007）；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是人體內(nèi)嘌呤代謝發(fā)生紊亂，致使血液中尿酸增高而引起的一種代謝性疾病。隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展，人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)改變，高尿酸血癥的患病率逐年增高，并呈年輕化趨勢，已成為僅次于糖尿病的第二大代謝性疾?。?］。有研究發(fā)現(xiàn)，在細胞、動物水平，及高尿酸血癥患者血液中不同的microRNA可能參與了高尿酸血癥的多個病理過程，如抑制血管再生、形成尿酸鹽結(jié)晶、損傷腎功能等，從而在一定程度上影響高尿酸血癥的發(fā)生發(fā)展［2］，但其發(fā)病機制目前仍不十分清楚。

1 對象與方法

1.1研究對象本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院倫理委員會批準，收集2016年7-12月期間就診于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院的原發(fā)性無癥狀高尿酸血癥患者及體檢中心的健康人群，獲得受試者知情同意并簽署知情同意書，每組3例。其中男5例，女1例，年齡24～28周歲。

1.2主要實驗試劑和儀器設(shè)備TRIzol LS Re-agent（美國Invitrogent公司），超速離心機（Optima XPN-90美國Beckman公司），Illumina NexSeq 500（美國Illumina公司）；PMSF（Amresco 0754 Biosharp公司），Leupeptin（Amresco J580 Biosharp公司），DTT（Amresco 0281 Biosharp公司）等。

1.3實驗方法

1.3.1尿液外泌體分離每位受試者收集隨機中段尿液標本140 mL，每70 mL尿液中加入350 μL 0.1 mol/L的PMSF和42 μL 0.001 mol/L的Leupeptin，通過超速離心機低溫差速離心法（4℃17 000×g離心30 min；4 ℃ 200 000×g離心60 min）收集外泌體，每70 mL尿液管底沉淀物用56 μL 0.01 mol/L的PBS緩沖液懸浮混勻后加入等體積含60 mg/mL DTT的上樣緩沖液；于恒溫水浴箱中60℃加熱10 min；最后置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2樣本總RNA的抽提使用TRIzol法提取外泌體中的總RNA，用NanoDrop ND-1000測定樣本總RNA濃度和純度。

1.3.3microRNA表達譜測序在每個樣本總RNA的3′和5′端添加RNA接頭，使用Illumina RT引物和擴增引物進行反轉(zhuǎn)錄擴增，隨后從PAGE膠上挑選130～150 bp的PCR擴增片段，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文庫。再將樣本滴定到最終濃度8 pmol/L，并根據(jù)Illumina NexSeq 500說明書，使用TruSeq Rapid SR cluster Kit在Illumina cBot上進行簇生成。最后使用TruSeq Rapid SBS Kit在Illumina NextSeq 500測序儀上進行50個周期的測序。再計算兩組樣品間各microRNA的差異倍數(shù)（Fold change），把區(qū)別兩組間差異表達的閾值設(shè)定為1.5倍，即上調(diào)＞1.5倍的，F(xiàn)old Change＞1.5，下調(diào)＞ 1.5倍的，F(xiàn)old Change＜ 1/1.5（0.67），組間參數(shù)檢驗應(yīng)用t檢驗，非參數(shù)檢驗應(yīng)用Mann-Whitney秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，最后根據(jù)Fold Change和P值篩選差異microRNA，繪制microRNA聚類圖。該測序過程主要由上?？党缮镉邢薰就瓿?。

1.3.4實時熒光定量PCR先將microRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計microRNA與內(nèi)參基因U6的反應(yīng)引物，再通過384-PCR板于Real-time PCR儀上進行PCR反應(yīng)。利用2-△△CT方法分析microRNA相對表達量，再將2-△△CT與Fold change進行比較，驗證microRNA高通量測序結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1樣品總RNA濃度和純度檢測結(jié)果外泌體總RNA經(jīng)NanoDrop ND-1000檢測，OD260/OD280在1.68～1.74之間，接近于1.80，OD260/OD230均＞ 1.8，基本滿足后續(xù)microRNA測序及PCR要求。

2.2microRNA表達譜結(jié)果通過高通量測序成功構(gòu)建高尿酸血癥組和正常對照組尿液外泌體源性microRNA表達譜，共篩選出表達差異的已知microRNA 10種（表1），其中1種上調(diào)，為hsa-miR-32，9種下調(diào)，分別為hsa-miR-1246、hsa-miR-3615、hsa-miR-1、hsa-miR-204、hsa-miR-126、hsa-miR-320d、hsa-miR-320c、hsa-miR-3158、hsa-miR-6510；并篩選出表達差異的新microRNA 2種（表2），均表達下調(diào)，分別為hsa-miR-novel-chr2_38600（AUCUGC）、hsa-miR-novel-chr18_21650（GGAAUG）。

表1 高尿酸血癥組較對照組差異表達的已知microRNATab.1 The differentially expressed known microRNA in hyperuricemia and control group

表2 高尿酸血癥組較對照組差異表達的新microRNATab.2 The differentially expressed new microRNA in hyperuricemia and control group

將表達差異的10種已知microRNA進行聚類分析，繪制分層聚類圖，其樣品聚類特征樹中高尿酸血癥組和正常對照組各聚為一類，說明同組樣本間的該組microRNA表達相似性較強，重復(fù)性良好，而組間各樣本該組microRNA表達差異較顯著（圖1），該組差異表達的microRNA可能參與了高尿酸血癥的發(fā)生發(fā)展，并可能成為診斷高尿酸血癥的新型無創(chuàng)生物標志物。

2.3實時熒光定量PCR結(jié)果采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測3個microRNA，其中hsa-miR-1和hsa-miR-205 的2-△△CT與 Fold chage相比總體上調(diào)、下調(diào)趨勢一致且差異倍數(shù)相近，但hsa-miR-32的實時熒光定量PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果相比上調(diào)、下調(diào)趨勢不符（表3）。因此microRNA高通量測序是一種快速有效篩選差異表達microRNA的方法，其結(jié)果可供參考，但仍需實時熒光定量PCR進一步驗證。

圖1 差異表達已知microRNA聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis diagram of differentially expressed known microRNA

表3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果與microRNA高通量測序結(jié)果比較Tab.3 Comparison of qPCR and high-throughput sequencing microRNA

3 討論

microRNA最早是由LEE等［3］在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為21-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。尿液中的外泌體能選擇性的富集其來源細胞的多種蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA等，包含了豐富的生物標志物信息，其microRNA比尿液細胞中的更加穩(wěn)定。

有研究表明，microRNA可以作為多種疾病的生物學(xué)標記檢測指標［4］。然而，目前為止國內(nèi)外尚無針對尿液外泌體源性microRNA與高尿酸血癥的相關(guān)報道。本研究首次將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于高尿酸血癥患者尿液外泌體中microRNA的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10種已知microRNA表達差異，其中1種上調(diào)，9種下調(diào)，另有2種新microRNA均表達下調(diào)。

有研究報道，表達上調(diào)的miRNA-32在肝癌等惡性腫瘤中表達顯著上調(diào)，并可通過PTFN/Akt通路以促進肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力［5］；表達下調(diào)的miRNA-1能特異性的表達于心肌細胞和骨骼肌細胞，直接參與心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及病理生理過程，特別是心肌肥大、心肌梗死等，同時還調(diào)控了心肌病理狀態(tài)下心律失常的發(fā)生發(fā)展。XIAO等研究證實，心肌細胞在缺血-再灌注情況下miRNA-204表達下降，而LC3-II表達升高，miRNA-204可能通過調(diào)控LC3-II來調(diào)節(jié)心肌細胞的自溶作用。ROEL等［6］研究認為過表達的miRNA-126與SDF-1/CXCR4依賴的血管內(nèi)皮祖細胞的動員有關(guān)，可通過促進血管再生、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮祖細胞動員而維持血管穩(wěn)態(tài)，促進腎臟缺血再灌注損傷后腎功能的恢復(fù)。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達的尿液外泌體源性microRNA暫未證實與高尿酸血癥的直接相關(guān)性，部分還未有研究，但待今后大樣本、多中心的實時熒光定量PCR進一步論證后，通過生物信息學(xué)分析可揭示microRNA的功能及潛在的具體調(diào)控機制，為高尿酸血癥發(fā)病機制的研究提供依據(jù)，減少實驗盲目性。而且高尿酸血癥與痛風密不可分，并與心腦血管疾病、慢性腎臟病，以及2型糖尿病、肥胖等多種代謝性疾病密切相關(guān)［7-9］，microRNA在各種相關(guān)疾病中的研究可能為今后進一步研究高尿酸血癥與該疾病的相關(guān)性提供新的研究方向和依據(jù)。

聚類分析圖中差異表達的microRNA組在高尿酸血癥組和正常對照組中組間差異顯著，其差異表達的microRNA組有望成為診斷高尿酸血癥的新型無創(chuàng)生物標志物，并可作為今后治療與監(jiān)測的靶點。另外，本次測序發(fā)現(xiàn)了較多表達差異的新microRNA，亦待今后更深入的研究。