梁景云 伍松姣 徐文麗 潘可學(xué) 王小芳

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院（南寧 530001）；2梧州市人民醫(yī)院（廣西梧州 543000）

膿毒癥是感染因素所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征［1］。細(xì)胞凋亡在諸如炎癥反應(yīng)等多個(gè)病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能；內(nèi)毒素能夠誘發(fā)炎癥介質(zhì)釋放并啟動級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞面臨缺血缺氧、細(xì)菌感染等狀態(tài)時(shí)，可促使核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）被激活并移至細(xì)胞內(nèi)，與NF-κB特異性DNA位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。炎性因子的表達(dá)會受到NF-κB調(diào)控影響。NF-κB所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)與誘發(fā)急性缺血性腎損傷密切相關(guān)［2-3］。腎小管上皮細(xì)胞屏障損傷是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的特征。血清表面活性蛋白D（surface active protein D，SP-D）能促進(jìn)免疫系統(tǒng)對致病原的清除，可抑制炎性因子的釋放和淋巴細(xì)胞的增生。AKI SP-D 11thr/蘇氨酸基因型患者容易發(fā)生AKI，其機(jī)制與血清中SP-D水平相關(guān)［4-6］。SP-D可清除侵入肺部病原體，避免因炎癥反應(yīng)加劇和組織損傷［7-8］。本研究探究SP-D緩解膿毒癥通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和NF-κB介導(dǎo)的炎癥誘發(fā)AKI機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物鼠齡8～10周的野生型C57BL/6雄性小鼠：購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室；鼠齡8～10周的SP-A/D KO雄性小鼠：由美國加利福尼亞大學(xué)的Hawgood教授的實(shí)驗(yàn)室提供。體質(zhì)量20～25 g。

1.1.2試劑戊巴比妥鈉（榕柏生物技術(shù)有限公司，上海）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的ELISA試劑盒（吉泰依科賽生物科技有限公司，上海）；NF-κB抗體（Uene Tex，美國）。

1.2方法

1.2.1分組C57BL/6小鼠144只，分4組（n=36）：SP-D 敲除組（KO）、SP-D 野生組（WT），兩組均設(shè)置手術(shù)組（Sepsis）和假手術(shù)組（Sham），即WT sham組、KO sham組、WT sepsis組、KO sepsis組，假手術(shù)組為對照組。小鼠術(shù)前12 h禁飲食、麻醉。手術(shù)組小鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)：備皮，腹正中切口1.5 cm，取出盲腸，在回盲瓣以下0.5 cm處用4號絲線環(huán)扎盲腸，用12號針頭在回盲端頂部穿刺貫通，擠壓糞便后將盲腸還納，逐層縫合。假手術(shù)組小鼠不進(jìn)行盲腸環(huán)扎及穿孔，余同手術(shù)組。

1.2.2取材小鼠盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)后6及24 h，摘除單側(cè)眼球取血清0.7～1 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液入EP管置于-80℃冰箱。剪斷腹主動脈放血，結(jié)扎剖取雙側(cè)腎臟組織置于-80℃。

1.2.3血清中TNF-α及MCP-1測定用ELISA測模型建立后6及24 h血清TNF-α和MCP-1含量，測定按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4凋亡細(xì)胞檢測根據(jù)酶溶解組織提取細(xì)胞的方法取材。用鈣結(jié)合蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）雙染色法和流式細(xì)胞儀測定組織凋亡細(xì)胞。

1.2.5腎臟組織中NF-κB和SP-D的測定ELISA法測定腎臟組織中NF-κB水平，Western blot法測定NF-κB和SP-D在腎臟組織的表達(dá)。

1.2.6TUNEL檢測小鼠腎臟用10%的甲醛進(jìn)固定，石蠟包埋，經(jīng)腎門縱向4 μm厚連續(xù)切片6張，用TUNEL法檢測凋亡。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平術(shù)后6 h WT sepsis組和KO sepsis組血清TNF-α水平高于對照組（P＜0.05），且KO sepsis組TNF-α水平高于WT sepsis組（P＜0.05）；術(shù)后24 h WT sham組與KO sham組小鼠血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），WT sepsis組和KO sepsis組血清TNF-α水平高于對照組（P＜0.05），且KO sepsis組TNF-α水平高于WT sepsis組（P＜0.05）；術(shù)后 24 h WT sepsis組及KO sepsis組的TNF-α水平高于術(shù)后6 h（P＜0.05）。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平Tab.1 TNF-α levels at different time points ± s，pg/mL

表1 不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平Tab.1 TNF-α levels at different time points ± s，pg/mL

注：與WT sham組比較，*P＜0.05；與KO sham組比較，△P＜0.05；與WT sepsis組比較，#P＜0.05

時(shí)間點(diǎn)6 h 24 h P值WT sham組362.8±14.8 355.1±14.0＞0.05 KO sham組364.0±18.4 364.4±17.1＞0.05 WT sepsis組604.6±24.6*874.6±41.0*＜0.05 KO sepsis組808.9 ± 40.8△#1 239.0 ± 58.1△#＜0.05

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)血清MCP-1水平術(shù)后6 h WT sepsis組和KO sepsis組血清MCP-1水平高于對照組（P＜0.05），且KO sepsis組MCP-1水平高于WT sepsis組（P＜0.05）；術(shù)后24 h WT sepsis組和KO sepsis組血清MCP-1水平高于對照組（P＜0.05），且KO sepsis組MCP-1水平高于WT sepsis組（P＜0.05）；術(shù)后 24 h WT sepsis組及 KO sepsis組的MCP-1水平高于術(shù)后6 h（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血清MCP-1水平Tab.2 MCP-1 levels at different time points ±s，pg/mL

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血清MCP-1水平Tab.2 MCP-1 levels at different time points ±s，pg/mL

注：與WT sham組比較，*P＜0.05；與KO sham組比較，△P＜0.05；與WT sepsis組比較，#P＜0.05

時(shí)間點(diǎn)6 h 24 h P值WT sham組45.4±1.9 46.7±1.8＞0.05 KO sham組47.3±2.4 48.6±2.3＞0.05 WT sepsis組67.2±2.7*99.5±4.7*＜0.05 KO sepsis組91.9 ± 4.6△#165.2 ± 7.7△#＜0.05

2.3 膿毒癥小鼠腎臟組織中SP-D表達(dá)的變化在WT小鼠的腎臟中發(fā)現(xiàn)SP-D的表達(dá)，使用肺作為陽性SP-D KO對照并且SP-D KO小鼠腎臟作為陰性對照，術(shù)后6和24 h SP-D表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖1、2。

2.4 腎臟細(xì)胞凋亡膿毒癥的腎臟中可見棕色核的凋亡細(xì)胞，與膿毒癥建模后24 h的WT小鼠相比，來自膿毒性SP-D KO小鼠的腎臟中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目高（P＜0.05）。見圖3、4。

2.5 腎臟NF-κB水平變化在膿毒癥造模后6和24 h，膿毒癥小鼠中NF-κB的水平增加（P＜0.05）。膿毒性SP-D KO小鼠的腎臟中NF-κB的水平高（P＜0.05）。見表3和圖5。

3 討論

膿毒癥誘發(fā)AKI的本質(zhì)是大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子導(dǎo)致的過度失控性的炎性反應(yīng)［9-10］。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下，產(chǎn)生TNF-α、白介素等促炎因子，啟動炎性反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)［11］。內(nèi)毒素血癥是AKI發(fā)病的始動核心環(huán)節(jié)［12］。

圖1 膿毒癥小鼠腎臟組織中SP-D表達(dá)的變化Fig.1 The changes of SP-D expression in renal tissue of septic mice

圖2 膿毒癥小鼠腎臟組織中SP-D表達(dá)的變化（Western blot）Fig.2 The changes of SP-D expression in renal tissue of septic mice（Western blot）

圖3 SP-D KO和WT膿毒癥小鼠的腎臟細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Renal cell apoptosis in septic mice with SP-D KO and WT

圖4 SP-D KO和WT膿毒癥小鼠的腎臟細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Renal cell apoptosis in septic mice with SP-D KO and WT（TUNEL × 200）

表3 腎臟NF-κB表達(dá)變化Tab.3 The changes of NF-kappa B level in kidney of SP-D KO and WT sepsis mice ± s

表3 腎臟NF-κB表達(dá)變化Tab.3 The changes of NF-kappa B level in kidney of SP-D KO and WT sepsis mice ± s

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與 6 h組比較，#P＜0.05

分組WT KO P值Sham 0.14±0.07 0.20±0.07＞0.05 6 h 0.26±0.10*0.67±0.18*＜0.05 24 h 0.82±0.16*#0.94±0.20*#＜0.05

圖5 腎臟NF-κB表達(dá)變化Fig.5 The changes of NF-kappa B expression in kidney（Western Blot）

炎性介質(zhì)和氧自由基通過引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致生物膜損傷，引起細(xì)胞壞死和凋亡［13］。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，通過與B細(xì)胞免疫球蛋白的輕鏈K鏈基因增強(qiáng)子序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，引起多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，因此NF-κB通路在機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中起核心作用。故抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑能夠減輕膿毒癥誘發(fā)AKI的炎癥反應(yīng)，對盲腸結(jié)扎穿孔的膿毒癥小鼠的研究表明受累的肺組織中SP-D表達(dá)增高。

本研究中，建模術(shù)后6 h血清TNF-α和MCP-1水平升高，WT小鼠和SP-D KO小鼠在24 h血清TNF-α和MCP-1水平增加，與膿毒癥SP-D KO相比WT小鼠具有更高的緩解感染的活性。在術(shù)后24 h膿毒癥WT和KO小鼠凋亡細(xì)胞的定量分析結(jié)果顯示來自膿毒性SP-D KO小鼠的腎臟中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目更高。在膿毒癥造模后，膿毒癥小鼠中NF-κB的水平顯著增加，來自膿毒性SP-D KO小鼠的腎臟中的NF-κB的水平與WT小鼠相比更高。腎臟中SP-D水平的降低進(jìn)一步減弱了SP-D在機(jī)體防御和抗炎調(diào)節(jié)以及細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用。這是因?yàn)镾P-D在機(jī)體防御和先天性免疫方面發(fā)揮重要作用，其具有膠原結(jié)合區(qū)域，其基于鈣網(wǎng)蛋白-CD91復(fù)合物可發(fā)揮其抗炎作用，有助于減少暴露于病原體、過敏原而誘發(fā)的凋亡。

綜上所述，在膿毒癥誘發(fā)AKI模型中SP-D在腎臟中的表達(dá)增加后能夠通過降低血清中的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和MCP-1活性，并通過抑制NF-κB的活性和細(xì)胞凋亡減輕了膿毒癥誘導(dǎo)的AKI而發(fā)揮保護(hù)作用。