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        COX-2、MMP-9和VEGF在子宮腺肌病異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

        2018-12-29 01:57:32李燦宇劉歡歡王婷婷陳增鑫申愛榮封全靈
        實用醫(yī)學(xué)雜志 2018年23期
        關(guān)鍵詞:腺肌病異位免疫組化

        李燦宇 劉歡歡 王婷婷 陳增鑫 申愛榮 封全靈

        鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科(鄭州 450052)

        子宮腺肌病嚴(yán)重危害婦女健康,但仍缺乏有效的臨床治療策略[1]。子宮腺肌病可能具有較為獨特的分子病理學(xué)特征[2],了解其發(fā)病機(jī)制對尋找有效治療策略有重要意義。本課題組前期研究表明COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)下降與子宮腺肌病間質(zhì)細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。為進(jìn)一步探討三者與子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,本研究通過免疫組化研究了子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、MMP-9的蛋白表達(dá)及相關(guān)性,通過分離間質(zhì)細(xì)胞,實時定量PCR(real-time PCR)和western blot方法檢測了子宮腺肌病組織間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá),并觀察了間質(zhì)細(xì)胞中COX-2基因沉默對VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

        1 資料與方法

        1.1一般資料標(biāo)本來自2013年12月至2015年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術(shù)的子宮腺肌病患者,收集在位、異位內(nèi)膜新鮮組織各30例,選取同期正常內(nèi)膜新鮮組織10例(排除子宮腺肌病、內(nèi)膜異位癥及其他婦科良性疾?。┳鳛檎φ?,另外收集40例異位內(nèi)膜組織石蠟包埋標(biāo)本。全組病例年齡25~54歲(各組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義),術(shù)前3個月無激素使用史,診斷經(jīng)腹腔鏡、病理診斷證實。手術(shù)室中獲取無菌標(biāo)本后立即置于無菌4℃預(yù)冷的含有青、鏈霉素的DMEM/F-12(FD)培養(yǎng)液,1 h內(nèi)送至實驗室在生物安全柜中進(jìn)行培養(yǎng)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審議同意,所有標(biāo)本采集均經(jīng)患者知情同意。兔抗人多克隆抗體COX-2(12375-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

        1.2方法

        1.2.1免疫組化檢測兔抗人多克隆抗體COX-2(12375-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。兔抗人單克隆抗體MMP-9(ZA-0562)和兔抗人多克隆抗體VEGF(ZA-0509)購自北京中杉金橋生物科技有限公司。所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理變化,用Envision免疫組化二步法檢測蛋白表達(dá)情況。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,陽性對照切片由試劑公司提供,染色結(jié)果陽性。陰性對照用PBS緩沖液代替一抗,染色結(jié)果陰性。

        1.2.2免疫組化結(jié)果判定方法每張切片選10個高倍視野(400倍),根據(jù)染色程度及染色范圍來計算評分。按陽性細(xì)胞所占百分比評分:無陽性細(xì)胞者為0分,1%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,76%~100%為4分;按染色強(qiáng)度評分:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。以陽性細(xì)胞所占百分比與染色強(qiáng)度評分的乘積為總評分,總評分≤6為低表達(dá),總評分>6為高表達(dá)。

        1.2.3實時熒光定量PCR檢測間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定,siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備和瞬時轉(zhuǎn)染方法見前期研究[3]。提取各組細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL,包含SYBR Green Master(ROX)試劑10 μL、上下游引物各 0.6 μL、模板 cDNA 1.0 μL 和 RNase-Free Water 7.8 μL;擴(kuò)增程序為 95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60℃1 min,共40個循環(huán)。生成定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,計算機(jī)分析Ct值。計算方法:目的基因的相對定量值 =2-△△Ct。抑制率(%)=(1-干擾組COX-2 mRNA相對表達(dá)量/空白對照組COX-2 mRNA相對表達(dá)量)×100%。

        1.2.4Western blot檢測收集轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞提取總蛋白,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜;用1×PBS配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,棄去牛奶,加入一抗兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9和鼠抗人β-actin抗體(cell signal technology),于4℃下孵育過夜;PBST洗滌3次,用HRP標(biāo)記的抗鼠的二抗于室溫孵育2 h后檢測。

        1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(ANOVA),多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小意義差異法(LSD-t檢驗)或Tamhane′s T2法,兩獨立樣本均數(shù)之間的比較采用t檢驗。用χ2檢驗分析COX-2、MMP-9和VEGF高表達(dá)情況,采用Pearson相關(guān)性檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9高表達(dá)及其相關(guān)性COX-2、VEGF和MMP-9蛋白主要在異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)(圖1),子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白高表達(dá)率分別為57.5%(23/40)、45.0%(18/40)和37.5%(15/40)。Pearson相關(guān)性分析顯示COX-2和VEGF高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.676,P=0.000),COX-2和MMP-9高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.457,P=0.003),MMP-9和VEGF高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.441,P=0.004)。

        2.2子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、VEGF和MMP-9 mRNA的相對表達(dá)如表1所示,子宮腺肌病患者離體培養(yǎng)的在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)均明顯高于正常對照組(P<0.05),且異位間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于對應(yīng)在位內(nèi)膜(P<0.05)。

        2.3子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達(dá)如表2所示,子宮腺肌病組患者離體培養(yǎng)的在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達(dá)均明顯高于正常對照組(P<0.05),且異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯高于對應(yīng)在位內(nèi)膜(P<0.05)。

        圖1 免疫組化檢測COX-2、VEGF和MMP-9蛋白在異位內(nèi)膜組織腺體和間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(Envision二步法,箭頭示間質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá))Fig.1 Expression of COX-2,VEGF and MMP-9 proteins in adenomyosis ectopic endometrium by immunohistochemistry(Envision staining,arrows show positive stromal cells)

        表1 子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常對照組間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達(dá)(n=10)Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2,MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells(n=10) ± s

        表1 子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常對照組間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達(dá)(n=10)Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2,MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells(n=10) ± s

        注:與正常對照組比較,*P<0.05;與對應(yīng)在位內(nèi)膜組比較,△P<0.05

        組別異位內(nèi)膜組*△在位內(nèi)膜組*正常對照組COX-2 3.460 7±0.312 2.193 3±0.599 1.467 0±1.280 VEGF 3.921 4±0.690 2.654 9±0.628 1.245 3±0.729 MMP-9 2.747 3±0.972 1.557 7±0.590 1.012 5±0.162

        表2 子宮腺肌病和正常對照間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達(dá)(n=10)Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2,MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells(n=10) ± s

        表2 子宮腺肌病和正常對照間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達(dá)(n=10)Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2,MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells(n=10) ± s

        注:與正常對照組比較,*P<0.05;與對應(yīng)在位內(nèi)膜組比較,△P<0.05

        組別異位內(nèi)膜組*△在位內(nèi)膜組*正常對照組0.795 6±0.012 0.694 4±0.016 0.245 3±0.016 0.885 5±0.018 0.782 8±0.015 0.122 6±0.008 0.818 8±0.007 0.712 4±0.129 0.074 0±0.009 COX-2VEGF MMP-9

        2.4COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對表達(dá)沉默COX-2基因后,與陰性對照組和空白對照組相比,子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對表達(dá)量均顯著下降,陰性對照組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3、4)。

        表3 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達(dá)(n=10)Tab.3 Relative expression of COX-2,MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing(n=10) ± s

        表3 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達(dá)(n=10)Tab.3 Relative expression of COX-2,MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing(n=10) ± s

        注:與陰性組比較,*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05,#P>0.05

        組別干擾組*△陰性組#空白組COX-2異位0.897 8±0.025 3.162 4±0.485 3.460 7±0.3120在位0.919 2±0.163 1.936 7±0.096 2.193 3±0.599 VEGF異位1.082 5±0.310 3.168 1±0.356 3.921 4±0.690在位1.442 3±0.223 2.432 9±0.467 2.654 9±0.628 MMP-9異位0.768 0±0.268 2.438 9±0.302 2.747 3±0.972在位0.791 2±0.173 1.648 9±0.351 1.557 7±0.590

        表4 COX-2基因沉默后各組VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s,%

        表4 COX-2基因沉默后各組VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s,%

        注:與對應(yīng)在位內(nèi)膜組,*P<0.05

        組別子宮腺肌病異位內(nèi)膜組*子宮腺肌病在位內(nèi)膜組VEGF 71.80±9.25 42.15±17.69 MMP-9 70.79±8.30 41.50±27.48

        2.5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達(dá)沉默COX-2基因后,與陰性對照組和空白對照組相比,子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達(dá)量均顯著下降,陰性對照組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2,表5、6)。

        圖2 Westernblot檢測COX-2基因沉默后AM各組及正常對照組ESC中COX-2、VEGF及MMP-9蛋白相對表達(dá)Fig.2 Relative expression of COX-2,MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis and controls after COX-2 gene silencing detected by western-blot

        表5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達(dá)Tab.5 Relative expression of COX-2,MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

        表5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達(dá)Tab.5 Relative expression of COX-2,MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

        注:與陰性組比較,*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05,#P>0.05

        組別干擾組*△陰性組#空白組COX-2異位0.453 6±0.014 0.785 3±0.009 0.795 6±0.012在位0.469 5±0.010 0.691 4±0.015 0.694 4±0.016 VEGF異位0.369 5±0.008 0.886 2±0.012 0.885 5±0.018在位0.495 2±0.015 0.780 8±0.015 0.782 8±0.015 MMP-9異位0.290 6±0.009 0.812 9±0.010 0.818 8±0..007在位0.387 5±0.007 0.706 0±0.013 0.712 4±0.129

        表6 COX-2基因沉默后子宮腺肌病各組VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s,%

        表6 COX-2基因沉默后子宮腺肌病各組VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s,%

        注:與對應(yīng)在位內(nèi)膜組,*P<0.05

        組別異位內(nèi)膜組*在位內(nèi)膜組VEGF 58.25±1.53 36.69±3.01 MMP-9 64.50±1.16 45.59±1.75

        3 討論

        子宮腺肌病是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞在子宮肌層彌漫性或局限性生長,引起痛經(jīng)、月經(jīng)過多和不孕不育,嚴(yán)重影響患者身心健康的一種疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[4]。目前的研究認(rèn)為AD發(fā)病的分子機(jī)制包括5個方面:炎性因子、細(xì)胞外基質(zhì)酶、生長因子、性激素受體及神經(jīng)血管生成因子[5]。子宮內(nèi)膜的異位侵襲及血管生成是子宮內(nèi)膜侵入肌層并生長發(fā)育的必備條件,新生血管的形成需要多種血管形成相關(guān)因子的協(xié)同作用,包括VEGF、COX-2、MMP及血管生成素(angiogenin,Ang)等[6]。其中COX-2、MMP和VEGF分別代表了AD發(fā)病機(jī)制中的炎性因子、細(xì)胞外基質(zhì)及生長因子三個方面,研究其三者與AD的關(guān)系可以進(jìn)一步探索AD的發(fā)生機(jī)制,為其靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

        COX-2為花生四烯酸合成酶的限速酶,可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻GE2,PGE2作為芳香化酶P450的誘導(dǎo)因子,可促進(jìn)E2的合成,E2又可刺激COX-2的合成,故COX-2、PGE2、P450、E2形成了一個惡性循環(huán)[7]。在子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型中抑制COX-2可通過降低PGE2的表達(dá)水平,從而抑制VEGF表達(dá)影響血管生成[8]。這些研究提示COX-2可能是影響子宮內(nèi)膜異位疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因子。

        VEGF作為最強(qiáng)的血管生成因子,其高水平表達(dá)與子宮腺肌病發(fā)生關(guān)系密切,其高表達(dá)的致病機(jī)制尚不清楚[9]。雌激素可通過誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)及血管生成促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生[10]。MMP-9是一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶,其高表達(dá)與AD的發(fā)生密切相關(guān)[11],多種信號通路可通過調(diào)節(jié)MMP-9參與子宮腺肌病的發(fā)生[12]。本研究通過免疫組化方法檢測了子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白表達(dá),結(jié)果顯示三者在子宮腺肌病組織中均呈高表達(dá),且存在顯著正相關(guān)。結(jié)果提示COX-2可能與VEGF、MMP-9一起共同參與了子宮腺肌病的發(fā)生和異位侵襲。

        子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化是子宮腺肌病發(fā)生的重要分子病理機(jī)制,間質(zhì)細(xì)胞增殖和侵襲成為子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的重要因素[13-14]。子宮腺肌病的內(nèi)膜異位的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的惡性侵襲行為類似,有研究表明,在腫瘤細(xì)胞中選擇性抑制COX-2表達(dá)能顯著改變VEGF和MMP-9表達(dá),并抑制腫瘤發(fā)展[15]。本研究通過對間質(zhì)細(xì)胞的分離和鑒定,檢測了間質(zhì)細(xì)胞中MMP-9、VEGF和COX-2的表達(dá)情況,結(jié)果顯示三者在子宮腺肌病內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常對照,尤其在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中更為顯著,結(jié)果提示三者表達(dá)上調(diào)可能在間質(zhì)細(xì)胞侵襲中發(fā)揮重要作用。而當(dāng)在子宮腺肌病間質(zhì)細(xì)胞中沉默COX-2基因后,在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中VEGF、MMP-9的表達(dá)顯著下調(diào),尤其在異位間質(zhì)細(xì)胞中更為明顯。這提示子宮腺肌病間質(zhì)細(xì)胞中COX-2可能是VEGF、MMP-9通路的上游因子,COX-2可能通過對VEGF、MMP-9表達(dá)調(diào)節(jié)參與了該疾病的發(fā)生,針對該通路機(jī)制有望探索子宮腺肌病新的治療策略。

        目前AD的發(fā)病病因不明,研究多限于從患者或動物模型中檢測不同因子在AD及對照組織中的表達(dá)情況。本研究同時從細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢測MMP-9、VEGF和COX-2在AD中的表達(dá)情況,同時對三者的相互關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果表明三者共同參與了AD發(fā)生發(fā)展,COX-2可能是AD發(fā)病的關(guān)鍵因子,有望成為治療AD的分子靶點。本研究病例數(shù)也有一定局限性,尚需大樣本量的研究進(jìn)一步證實。

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